张绍武 张浩

(中国医科大学附属第四医院检验科, 沈阳 110032)

甲真菌病是最常见的皮肤科疾病之一，发病率约占临床甲病的一半以上，病原菌包括皮肤癣菌、酵母菌和其他非皮肤癣菌性丝状真菌等,国内甲真菌病病原菌中皮肤癣菌占65%～70%，酵母菌占10%～30%。甲真菌病常表现为甲板增厚、分离、变色等临床症状，其临床表现有时不易与白甲症、黄甲综合征、甲银屑病、甲扁平苔藓等指(趾)甲疾病鉴别[1-5]，因此，病原学检查是诊断和鉴别诊断甲真菌病的关键依据。

甲真菌病的实验室检查最常用的检测方法是镜检法，镜检法主要有KOH湿片镜检和荧光镜检。KOH湿片镜检法因操作简单快捷、成本低廉，为实验室普遍采用，但该法阳性率仅为57.5%～69.23%[4-7]，且易出现假阴性结果，导致临床漏诊或误诊；荧光染色法检出率为70%～85%，但需要荧光显微镜[8-10]。本研究尝试改变KOH湿片法的标本消化方法，探讨试管法KOH消化甲屑对甲真菌检测效果的影响，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

试剂 10% KOH(10 g KOH加入蒸馏水溶解至100 mL), CFW真菌荧光染色液(Sigma-Aldrich,美国默克公司)。

仪器 OLYMPUS显微镜(日本，普通光源型号CX41FR，紫外光源型号MF-UV-LED-0-4)。

标本 皮肤科门诊疑似甲真菌感染的患者标本160例。

1.2 方法

标本处理及检测 刮取病变处甲屑，平均分成3段，每段约(1～2)mm×(2～3)mm，编号为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。其所在组分别命名为玻片法组、试管法组和Ⅲ组。玻片法为将甲屑Ⅰ直接置于洁净玻片上，其上滴加20 μL 10% KOH，室温静置10 min后再加入20 μL CFW真菌荧光染色液混合，作用1 min后镜检。镜检后玻片法真菌检查阴性的甲屑及残存微量消化液(基本已风干)转入到0.6 mL无色灭菌离心管中，然后在离心管中加入10% KOH 20 μL，搅拌后静置10 min，将管中混合液全部置于洁净玻片上镜检。试管法为将甲屑Ⅱ转入0.6 mL无色灭菌离心管中，然后在离心管中加入20 μL 10% KOH，搅拌后室温静置10 min后将全部混合液置于洁净玻片上，上覆20 μL真菌荧光染色液作用1 min后镜检。将甲屑Ⅲ置于0.6 mL无色灭菌离心管中，加入0.1 mL 10% KOH溶液，搅拌后静置于室温环境中，分别在2 min、10 min、30 min、60 min、120 min混合溶液，然后用加样枪吸取5 μL甲屑混悬液滴于洁净载玻片上，标本上再滴加5 μL 真菌荧光染色液，盖上盖玻片静置1 min后镜检。

统计学方法 采用SPSS 19.0软件,计数资料以百分率(%)表示,两组之间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 玻片法和试管法检出阳性率比较

160例标本中玻片法检出76例阳性，阳性率为47.5%。试管法检出101例阳性，阳性率为63.12%。两组比较差别有统计学意义(χ2=79.925，P<0.05)。甲屑ⅠKOH玻片法镜检为阴性的84份标本转入试管中处理标本后镜检26例标本阳性，与KOH玻片法阳性数量之和是102份阳性，比KOH试管法甲真菌的阳性多1例，阳性率为63.75%，与KOH试管法的阳性率比较，差异无统计学意义(χ2=0.1011，P>0.05)。

2.2 玻片法和试管法显微镜下检测结果

甲屑Ⅰ经10% KOH作用10 min后，可见单个上皮细胞或少量上皮细胞团块，但甲屑主体仍致密，且未见菌丝(见图1A)；但将甲屑Ⅰ残余甲屑置于离心管中消化后，致密的甲屑主体分离为多个小的上皮细胞团块或上皮细胞，可见菌丝(见图1B)。甲屑Ⅱ经消化后，可见多处菌丝(见图1C)。

图1 KOH甲屑制片显微镜下图. A. 甲屑Ⅰ经10% KOH作用10 min(×40)；B. 甲屑Ⅰ镜检后残留物经10% KOH作用10 min(×400)；C. 甲屑Ⅱ经10% KOH作用10 min(×400)

2.3 标本处理时间与菌丝检出量关系结果

甲屑Ⅲ经10%KOH消化后，屑块不断软化、膨胀，消化2 h甲屑的KOH溶液近似胶冻状；且甲屑消化10 min时才可检出菌丝。甲屑检出菌丝的数量随着消化时间的延长增加，但消化1 h后检出的菌丝增幅渐缓，Ⅲ组随机限一份镜检真菌阳性标本作图，见趋势图2。

图2 甲屑Ⅲ消化时间和菌丝检出量的关系

3 讨 论

相同病损的甲屑标本，以10% KOH玻片法处理甲屑10 min时检出阳性率为47.5%，而经10% KOH试管法处理甲屑10 min时真菌检出阳性率为63.12%。KOH试管法和玻片法检测甲屑真菌的结果差异有统计学意义，推测是因为KOH消化甲屑的处理方式不同所致，传统KOH湿片法是将待测皮屑或甲屑标本放在洁净玻片中央，其上滴加1滴10% KOH溶液，消化片刻后镜检。但往往因甲屑角质层较厚，细胞间排列紧密，甲屑内部细胞很难接触至KOH，其中包裹的真菌成分不能暴露出来，造成漏诊；且有时背景杂乱、菌丝和细胞重叠部分不易分辨，造成误诊[10-11]。甲屑标本浸泡在装有10% KOH溶液的离心管中比浸泡在玻片上，甲屑与KOH接触面积更大，溶液固有的流动性更利于KOH消化甲屑中的细胞间基质、将包裹在其中的菌丝游离出来。甲屑ⅠKOH玻片法镜检为阴性的84份标本转入试管中处理标本后镜检26例标本阳性，与KOH玻片法阳性数量之和，与KOH试管法的阳性率比较差异无统计学意义，进一步验证了将甲屑置于离心管中消化比KOH玻片法可获得较好的检测结果，此结论与马元龙等[6]改变甲屑的处理方式可提高真菌检出率的结论一致。

Afshar等[12]对189例疑似皮肤真菌病患者检测发现，KOH消化标本30 min、2 h、超过6 h后采用荧光染色法检测标本的阳性率分别为53.44%、62.96%、64.02%。本研究结果和Afshar等学者的结果一致，即甲屑消化时间和菌丝检出量呈正相关。实验中消化后游离菌丝少于混杂菌丝，且游离菌丝多为菌丝片段，推测是上皮细胞从细胞团块中分离和搅拌时产生的力破坏所致。本实验用KOH消化甲屑，消化2 min时未能检出真菌、消化10 min时仅检出1处真菌菌丝，表明消化时间不足可影响甲屑真菌的检测结果，推测KOH消化时间不足可能是导致甲屑标本KOH湿片法阳性率较低的原因之一。甲屑消化1 h后菌丝数量随消化时间延长而增加的幅度减慢；且消化1 h镜检的甲屑标本中有约20处可检测出菌丝，检出菌丝的几率明显增加。

本研究探讨甲屑标本处理方法对真菌检测结果的影响，考虑到标本检测时间应满足临床的需要，认为将试管法处理甲屑1 h镜检可解决传统KOH湿片法消化不充分造成的真菌假阴性检测结果问题，提高真菌检出几率及提高检测人员的工作效率，适合临床推广应用。