夏慧 杨虹 张鹏飞 莫小辉 谭飞,

(1.安徽医科大学上海皮肤病临床学院，上海 200443; 2.同济大学附属皮肤病医院，上海 200443；3.上海交通大学医学院附属仁济医院，上海 200127)

难辨认癣是指皮损无典型的边缘发展、中心消退特征，边界不清，难以辨认，形似其他皮肤病的皮肤真菌病[1-3]。部分难辨认癣鳞屑较少、可见水(脓)疱[4-5]，患者就诊时皮屑不易取材，或是皮屑常覆盖外用药、衣服纤维等污染杂质，干扰诊断[6]，导致难辨认癣的误诊误治。真菌镜检虽能检测出真菌的存在，但并不能鉴定是何种真菌导致的感染；真菌培养能通过形态学及生理生化实验判断真菌种类，但所费时间长，可能存在假阴性[7]。因此，对有水(脓)疱表现的难辨认癣的诊断，有探索其他实验室真菌检测方法的必要。本研究采用PCR对表现为水(脓)疱难辨认癣患者的疱液标本进行检测，并通过比较荧光染色镜检、真菌培养等检测结果，判断 PCR在真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中的价值。

1 材料和方法

1.1 标本采集及处理

收集2020年7月—2021年10月就诊于我院(上海市皮肤病医院)门诊，初步诊断为“难辨认癣”且病变处存在水(脓)疱的患者，采集患者的疱液标本。疱的直径>5 mm或2～5 mm但数量≥3个。取材前先用75%乙醇局部消毒。疱壁完整者用5 mL注射器抽取患者疱液；疱壁破溃者则在消毒后用无菌拭子蘸取疱液分泌物，将拭子上的疱液洗脱于无菌生理盐水中。采集的疱液或棉签拭子洗脱液分为3部分： 1份放入无菌EP管中以备提取DNA，1份直接荧光镜检，1份接种于沙堡弱琼脂(Sabouraud's dextrose agar,SDA)培养基。取同一患者的疱周皮屑作为对照组。

1.2 仪器和试剂

SDA培养基和念珠菌显色培养基为科马嘉公司；BD Phoenix酵母菌鉴定系统；DNA 提取试剂盒购于天根生化科技有限公司；PCR试剂为 Promega 公司；引物合成及测序为杰李生物公司；酸洗玻璃珠产于 Sigma 公司。

1.3 疱液DNA 提取

将疱液离心后弃去上清，加入600 μL裂解液、酸洗玻璃珠(直径0.5 mm)，超声研磨仪研磨10次(频率90 Hz，70s/次)。65℃水浴20 min。加入试剂FG2 140 μL，冰浴5 min，然后4℃ 12 000 g离心10 min。将离心后的上清液转移至另一个无酶无外源DNA的1.5 mL离心管中，加入0.7体积的异丙醇，混匀离心2 min，吸弃上清液，室温放置晾干EP管。加入150 μL试剂FG3，300 μL无水乙醇，300 μL dd H2O，混匀转移至离心柱，洗液洗涤两次后，12 000 g空柱离心2 min，晾干离心柱。加入50 μL EB缓冲液溶解DNA。

1.4 PCR及产物测序

检测PCR反应按50 μL反应体系：每管加入GoTaq©Master Mixes 25 μL，正反引物各0.5 μL (引物浓度10 ng/μL),DNA标本模板1 μL。设1管阳性对照和1管阴性对照。反应条件：95℃预变性8 min，95℃变性1 min，55℃退火10s，72℃延伸1 min，共40个循环,最后72℃延伸7 min，4℃保存。配制1.5%琼脂糖凝胶，加入gelred核酸染料5 μL，取5 μL扩增产物、5 μL核酸Marker(100 bp)，于电泳凝胶板中用120V电泳30 min，在紫外透射仪上观察结果。扩增的目的基因为ITS，扩增产物的大小为600～700 bp，引物序列分别为：上游引物：5，ATGTTTGTTACGGCGGTTGT3，；下游引物:5，ATCTTTGTAATATACCGTCG3，。将有电泳条带的PCR产物外送测序，测序结果通过BLAST 进行比对以确认菌种。

1.5 疱液镜检及培养鉴定

取疱液标本置于载玻片上，滴加荧光染料，盖上盖玻片，于荧光显微镜下观察。取疱液标本接种于SDA培养基上，28℃培养2周。念珠菌转接于念珠菌显色培养基上，通过BD Phoenix酵母菌鉴定系统进行鉴定；丝状真菌通过观察菌落及镜下形态学特征、生长特性进行鉴定。

1.6 统计学处理

荧光染色镜检、真菌培养和PCR三种诊断方法有两种或两种以上为阳性，即视为真阳性，以此作为疱液标本诊断难辨认癣的金标准。应用SPSS 20.0软件进行数据统计分析，以Kappa值表示各方法与金标准的一致性，分别计算疱液样本中三种诊断方法的临床诊断敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值和准确度。P<0.05为有统计学差异。

2 结 果

2.1 一般资料

纳入研究表现为水(脓)疱的难辨认癣患者共34例，其中男18例，女16例。患者年龄为 8～84岁，平均年龄41.1±19.6岁，年龄中位数为36岁。34例患者的水(脓)疱多位于趾(指)间和(或)足(掌)跖，足(手)缘、足(手)背、躯干四肢各有分布。部分患者水(脓)疱临床表现如下：有伴鳞屑的小脓疱(图1A)；有覆盖药物、分泌物等污染物的大疱(图1B)；有位于掌跖角质深层的水疱(图1C)。

图1 A.边缘密集分布的脓疱；B.皮损边界不清，水(脓)疱的疱壁呈白色，部分融合，疱液浑浊，易破溃发展为糜烂渗出；C.水(脓)疱位于角质深层，不易破溃，疱液澄清略呈黄白色，破溃后伴有角质剥脱

2.2 疱液标本的镜检、培养及PCR结果分析

以疱液标本进行荧光染色镜检、真菌培养和PCR检查，三种实验室检查方法中有两种或两种以上阳性者视为真阳性，作为疱液标本诊断难辨认癣的金标准，共检出患者18例(52.9%)。在疱液中，荧光染色镜检、真菌培养和PCR的阳性检出率分别为58.8%、41.2%和64.7%，如表1 所示，三种实验室方法与金标准比较，Kappa值分别为0.881、0.767和0.761，荧光染色镜检的Kappa值在0.81～1的范围内，与金标准几乎完全一致；真菌培养和PCR的Kappa值均在0.61～0.80的范围内，与金标准高度一致。如表2所示，在疱液标本中，PCR敏感性高于真菌培养，与荧光染色镜检无差异；PCR的特异性低于真菌培养和荧光染色镜检；PCR的阳性预测值低于真菌培养和荧光染色镜检；PCR的阴性预测值高于真菌培养，与荧光镜检无差异；PCR的准确度低于荧光镜检，与真菌培养无差异。

表1 镜检、培养和PCR三种实验室方法阳性检出率与金标准的比较

表2 镜检、培养、PCR三种诊断方法的评价指标比较

2.3 真菌培养和PCR测序菌种鉴定结果

疱液标本进行真菌培养后，菌落及镜下形态学如图2所示。经形态学鉴定，检出阳性14例，其中红色毛癣菌12例(85.7%)，须癣毛癣菌2例(14.3%)。疱液标本DNA通过PCR，共扩增出22例500～700 bp的阳性条带，将PCR阳性产物进行测序比对。提取DNA、PCR扩增和测序比对在12 h内完成。测序比对结果显示红色毛癣菌12例(54.5%)，近平滑念珠菌2例(9.1%)，趾(指)间毛癣菌2例(9.1%)，6例(27.3%)丝孢酵母属真菌(包括3例阿萨希毛孢子菌、1例日本毛孢子菌、1例Trichosporonfaecale、1例未确定到种的丝孢酵母)。真菌培养和PCR产物测序结果如表3所示。大部分PCR阳性标本测序后，鉴定结果符合概率都能在99%以上，但仍有些PCR阳性的标本，测序结果符合率不高，包括1例培养为红色毛癣菌，PCR测序结果鉴定82%符合概率为丝孢酵母属。另有4例培养阴性而PCR阳性的标本，经过测序比对后分别： 1例91%为红色毛癣菌，1例79%为阿萨希毛孢子菌，1例96%为日本毛孢子菌，1例84%为Trichosporonfaecale。

图2 SDA培养14 d后形态学鉴定. A-B.红色毛癣菌菌落正面颗粒状，反面红褐色；C-D.须癣毛癣菌菌落正面绒毛状，反面棕黄色；E.红色毛癣菌，可见分支分隔菌丝及少量分生孢子(乳酚棉蓝染色，×400)；F.须癣毛癣菌,可见大量椭圆形侧生小分生孢子和分支分隔菌丝及螺旋菌丝(红色箭头所示,乳酚棉蓝染色，×400)

表3 培养菌株与ITS测序比对结果

(续表)

3 讨 论

难辨认癣是由皮肤癣菌感染后在各种内外因素作用下造成丧失原有典型皮损特征的真菌性皮肤病[1-3]。皮肤癣菌具有广泛的水解蛋白酶，能消化皮肤角质层、指甲或头发上的角质蛋白[8-10]，因此目前临床中主张通过采集皮屑或疱壁标本进行真菌学辅助以诊断皮肤真菌病[11-12]。但难辨认癣临床表现多样，当鳞屑较少，皮损处见水(脓)疱时[2-5]，能否通过检测疱液来确定有无真菌感染，这是一个值得探索的问题。在临床真菌学检查中，常通过直接镜检确定是否感染真菌，真菌培养后形态学鉴定等方法来鉴定真菌种类。然而，传统诊断方式存在直接镜检不能确定菌种、真菌培养需要2～4周且形态学鉴定存在主观性等缺点[13-15]。因此，采集有水(脓)疱表现的难辨认癣患者的疱液，进行PCR鉴定，通过与荧光染色镜检和真菌培养进行比对，确定PCR在真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中的价值。

在本研究中，真菌镜检使用了相较于KOH湿片法更灵敏的荧光染色法[6]，但PCR在疱液标本中的高阳性检出率仍得到了体现。三种方法的疱液阳性检出率为PCR>荧光染色镜检>真菌培养，这与Arca等[16]报道的甲屑标本和李筱芳[13]等报道的皮屑、甲屑标本的镜检检出率>PCR>培养结果不一样。原因可能是：①PCR本身具有高敏感性；②疱液标本相较于皮屑、甲屑等标本，所含抑制PCR反应的污染物少；③疱液标本相较于皮屑、甲屑标本，杂菌少，因而PCR产物更单一，更容易测序比对。

为了保证结果的可靠性，通过镜检、培养和PCR三种检测方法中两种或两种以上为阳性者视为真阳性，以此作为疱液样本诊断难辨认癣的金标准。结果显示荧光染色镜检、真菌培养和PCR 的Kappa值均>0.61,与金标准一致程度高。根据金标准，PCR和镜检的敏感性均高达100%，真菌培养也达到77.8%；培养的特异性最高，为100%，其次为荧光染色镜检，为87.5%，PCR的特异性也不低，为75%。规范的检验技术、丰富的临床检验经验和疱液标本相较皮屑污染少，可以提高敏感性。真菌培养鉴定出14例真菌菌种，PCR虽有22例阳性，但其中有5例疱液标本经PCR后测序比对结果符合度低于99% ，包括1例培养鉴定为红色毛癣菌，PCR测序后却有82%概率为丝孢酵母属真菌；另有4例培养阴性PCR阳性的标本，经过测序比对后分别： 91%为红色毛癣菌，79%为阿萨希毛孢子菌，96%为日本毛孢子菌，84%为Trichosporonfaecale。PCR相较真菌培养而言，确实能鉴定出更多的真菌及更多的种类，但污染菌引起假阳性的风险也更高，PCR的特异性也会降低。敏感性的提高可能导致特异性的降低，而准确度与敏感性和特异性有关，因此,PCR和真菌培养法检测疱液标本在诊断难辨认癣上的准确度相同，但均低于荧光染色镜检法。

传统真菌学检查存在直接镜检不能确定菌种、培养效率低、诊断延迟、形态学镜检鉴定存在主观性、培养物污染的可能性以及混合感染时培养物偏倚的可能性等缺点[13-14]，而采用PCR，将菌种鉴定时间缩短至数小时[15-17]，节省菌种鉴定时间，方便后续用药。本实验表明在用真菌性水(脓)疱诊断难辨认癣中，PCR有较好的敏感性和准确度。PCR相较荧光染色镜检能判定真菌种类，相较真菌培养能缩短时间，能为难辨认癣的临床快速诊断和及时治疗提供潜在的价值。