胡祥坤 潘春香 孙如坤 王艳杰 鹿 敏

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一，其中约85%以上为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，目前临床治疗方式有手术、化疗、放疗等，而对晚期NSCLC患者来说这些方式的效果均有限[1]。而近年来免疫疗法取得了长足的进展，程序性死亡配体-1(programmed death 1，PD-1)/程序性死亡受体配体-1(programmed death ligand 1，PD-L1)通路能够抑制T细胞活化，从而使肿瘤细胞逃离免疫系统监视[2]。而PD-1、PD-L1靶点抑制剂能够消灭肿瘤，这为临床开辟了一种新的治疗选择，在黑色素瘤、肺癌等疾病治疗过程中取得显著效果[3]。磷脂酰肌醇3-激酶(phosphati-dylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，又称AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)信号通路对肿瘤细胞血管生成、细胞增殖等具有一定的调控作用[4]。近来发现AKT、mTOR可能是治疗肺癌的有效靶分子，但具体作用机制尚未完全清楚[5]。因此，本研究旨在探讨Akt、mTOR和PD-L1表达与肺癌患者临床病理特征的相关性，为进一步应用应用针对Akt、mTOR和PD-L1的免疫治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2014年5月至2016年5月来我院就诊的肺癌患者96例，纳入标准：①经影像学及病理学结果确诊为NSCLC；②手术方式为R0切除；③患者临床资料完整；④预计生存时间>3个月以上。排除标准：①伴有其他恶性肿瘤患者；②伴有心脏、肾脏等重要器官功能障碍患者；③入组前4个月行抗肿瘤治疗；④妊娠或哺乳期妇女。本研究经医学伦理委员会同意。

1.2 方法

样本收集：取患者癌组织及癌旁组织，标本固定及包埋等处理按照我院病理科常规，经HE染色后再显微镜下观察，并根据2004版世界卫生组织肺癌组织学分类标准评估肿瘤标本组织学分级。免疫组化：采用SP法，石蜡切片用常规二甲苯脱蜡，梯度无水乙醇进行水化，将其置于3%的H2O2溶液中浸泡，PBS缓冲液清洗切片，共3次，加入正常山羊血清进行封闭20 min，加入兔抗人Akt、mTOR(按照1∶200稀释，购自美国CST公司)和PD-L1抗体(按照1∶200稀释，购自英国Abcam公司)多克隆抗体，37℃下孵育1 h，TBST冲洗2次。加入鼠兔通用二抗，37℃下孵育1 h，PBS冲洗2次，再加入DAB显色、苏木精复染、梯度酒精分化，并进行风干及封片，于显微镜下观察。染色用PBS液代替一抗作阴性对照，已知阳性染片做阳性对照。结果判定：参考文献[6]，PD-L1在肿瘤细胞以及癌间质细胞中均有表达，主要定位于细胞膜，切片染色为淡黄色至棕褐色，染色强度得分：无染色：0分，淡黄色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分；阳性细胞百分比得分：无阳性细胞记0分，阳性细胞<25%记为1分，阳性细胞数在25%～50%记为2分，阳性细胞数>50%记为3分；总分为染色强度得分×阳性细胞百分比得分；分数≤2分记为阴性；分数>2分记为阳性。Akt在细胞核及细胞质中均有表达，mTOR主要表达于细胞质，染色强度评分如下：无染色：0分，淡黄色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分；染色面积评分如下：0分为无细胞染色，染色面积<10%记为1分，染色面积10%～50%记为2分，染色面积50%～75%为3分，染色面积>75%为4分。以染色强度及面积的评分相加为最后得分，0～2分为阴性，3分及以上为阳性。

1.3 观察指标

所有患者入院后收集其一般资料，性别、年龄、病理类型、肿瘤部位、TNM分期、肿瘤大小、分化程度、淋巴是否转移。以电话及门诊形式对所有患者进行随访，随访内容包括：患者病情进展、影像学检查，记录患者生存情况，在第1年每3个月随访1次，第2～5年，每6个月随访1次，随访截止时间2021年5月。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0统计学软件进行统计分析，计数资料以率(%)表示，采用χ2检验，生存分析采用Kaplan-Meier法和Log-Rank检验进行，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PD-L1表达与NSCLC临床病理特征的关系

PD-L1主要在肺癌细胞及癌间质细胞中表达，96例患者癌细胞中PD-L1阳性率为58.33%，癌间质细胞中阳性表达率为63.54%。PD-L1表达与肿瘤部位、TNM分期、分化程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)，见表1。

表1 PD-L1表达与 NSCLC临床病理特征的关系/例

2.2 Akt、mTOR表达与NSCLC临床病理特征的关系

Akt在细胞核及细胞质中均有表达，mTOR主要在细胞质中表达，Akt及mTOR阳性表达率分别为60.42%、62.50%。Akt表达与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、病理类型、肿瘤部位无关(P>0.05)。mTOR表达与肿瘤部位、TNM分期、分化程度相关(P<0.05)，与患者性别、年龄、病理类型、肿瘤大小、淋巴结转移无关(P>0.05)，见表2。

表2 Akt、mTOR表达与NSCLC临床病理特征的关系/例

2.3 PD-L1与Akt、mTOR的关系

PD-L1在Akt阳性组中的表达率高于Akt阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)，PD-L1在mTOR阳性组中的表达率高于mTOR阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 PD-L1和Akt、mTOR的关系/例

2.4 Akt、mTOR和PD-L1的表达对患者总生存期的影响

随访5年，存活45例，总生存率为46.88%，PD-L1阴性组5年生存率为60.00%(24/40)，高于PD-L1阳性组的37.50%(21/56)(P<0.05)，Akt阴性组5年生存率为65.79%(25/38)，高于Akt阳性组的34.48%(20/58)(P<0.05)，mTOR阴性组5年生存率为72.22%(26/36)，高于mTOR阳性组的31.67%(19/60)(P<0.05)，见图1。

图1 PD-L1、Akt和mTOR的表达对患者总生存期的影响

3 讨论

肺癌是世界发病率及死亡率最高的癌症，NSCLC其常见类型，包括鳞状细胞癌、腺癌及大细胞癌，大部分NSCLC患者确诊时已为晚期，不能进行手术治疗，患者预后较差，因而探索NSCLC的发生机制和新的治疗方式显得尤为重要[7]。NSCLC的发展过程是多基因、多因素共同参与的结果，随着人们对肿瘤细胞免疫逃逸机制的深入了解，免疫治疗已成为目前的研究热点。

PD-1是CD28家族的成员之一，在人体内PD-1蛋白主要表达于肿瘤组织的T淋巴细胞及相关淋巴细胞[8]。PD-L1是一种协同信号分子，又称B7-H1，作为PD-1的主要配体，其已被证实广泛表达于多种肿瘤细胞表面[9]。正常情况下PD-1与PD-L1结合，通过调节T细胞与抗原提呈细胞或T细胞与靶细胞接触时间，介导免疫逃逸，从而导致肿瘤发生及发展[10]。研究表明[11]PD-1/PD-L1通路是肿瘤微环境中重要的“哨卡点”，其表达可能与肾癌、肺癌的临床病理特征及不良预后相关。还有研究表明[12]PD-1/PD-L1通路可作为肺癌个体化治疗的有效治疗靶点。本研究中，PD-L1主要在肺癌细胞及癌间质细胞中表达，96例患者癌细胞中PD-L1的阳性率为58.33%，癌间质细胞中阳性表达率为63.54%。而进一步研究PD-L1的表达与NSCLC患者临床病理特征发现，PD-L1的表达与肿瘤部位、TNM分期、分化程度相关。肿瘤部位存在差异，这可能与左、右肺部微环境存在一定差异相关[13]。而对于TNM晚期及分化程度较低患者，其PD-L1阳性表达率较高，这可能是PD-L1的阳性表达使得免疫细胞无法有效清除肿瘤细胞相关，使疾病进一步发展[14]。随访5年，PD-L1阴性组的5年生存率为60.00%，高于PD-L1阳性组的37.50%(P<0.05)，提示PD-L1阴性是预后较好的指标。

研究发现，约90%的NSCLC细胞株存在PI3K/AKT/MTOR通路的激活[15]。PI3K属于磷脂激酶家族，Akt是一种原癌基因，通过磷酸化多种转录因子，控制细胞的凋亡、侵袭及血管生成等过程。mTOR是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，是Akt的下游分子，从酵母到哺乳动物均广泛存在，能调节细胞的各过程，包括蛋白质合成、生长、代谢等，在子宫内膜癌、乳腺癌、胰腺癌中均发现mTOR表达水平异常升高。研究[16]表明PI3K/AKT/mTOR通路将有丝分裂信号传递给p70s6k，使细胞周期蛋白和CDK4表达上调，导致蛋白p21Cip1/WAF1和p27Kip1表达下调，促使细胞从G1期向S期进展。本研究中，Akt在细胞核及细胞质中均有表达，mTOR主要在细胞质中表达，Akt及mTOR阳性表达率分别为60.42%、62.50%，与既往结果相一致。本研究发现，Akt的表达与TNM分期、肿瘤大小、淋巴结转移、分化程度相关，mTOR的表达与肿瘤部位、TNM分期、分化程度相关。随访5年，发现Akt阴性组的5年生存率为65.79%，高于Akt阳性组的34.48%，mTOR阴性组的5年生存率为72.22%，高于mTOR阳性组的31.67%。由此可见Akt及mTOR与患者的临床病理特征及预后存在一定关系。

同时进一步研究发现，PD-L1在Akt阳性组中的表达率高于Akt阴性组，同时PD-L1在mTOR阳性组中的表达率高于mTOR阴性组，这提示PD-L1的表达与Akt、mTOR的表达均在一定联系。有研究发现[17]，PI3K/AKT/mTOR通路可影响肿瘤微环境内免疫细胞的活性及PD-1与PD-L1表达，参与免疫抑制微环境的形成，阻断PI3K/AKT/mTOR通路，恢复患者机体的免疫应答，增强抗肿瘤固有的免疫效应。当然本研究还存在一定不足，关于PD-L1、Akt、mTOR与患者预后关系仍需扩大大样本，并进行前瞻性、随机对照试验加以证实。

综上，Akt、mTOR和PD-L1过表达与NSCLC患者临床病理特征存在一定关系，对患者的预后判断起着重要的指导作用，为临床治疗提供新的思路。