付红萍 方梦婵 万益群

乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤，如能在早期及时发现，则患者治愈率较高，如发现过晚，则是不可避免的致命疾病[1]。因此，早期诊断在临床上具有重大意义。近年来的研究表明，肿瘤标志物在癌症患者的早期诊断、监测疾病进程、确定预后及帮助制定治疗方案中都发挥非常重要的作用[2-3]。因此，开展乳腺癌特异性肿瘤标志物筛查很有必要。

代谢组学是研究生命系统对病理生理刺激或基因修饰的多参数代谢反应的学科，通过分析各种生物样品(如血液、尿液、唾液及组织等)中的某些或全部代谢产物，建立代谢组(代谢物的定量集合)。目前，代谢组学被认为是一个功能强大的技术，广泛应用于各类肿瘤标志物的筛查和改变的代谢途径的识别。代谢组学研究中使用的主要分析技术有质谱分析技术和核磁共振技术，其中质谱分析技术灵敏度较高，被广泛应用于潜在的肿瘤标志物的筛查研究[4]。

本文采集了乳腺癌女性患者和健康人的血清样本，应用气相色谱-质谱法，通过对血清样本进行分析，建立了乳腺癌血清代谢指纹图谱，并对实验数据进行统计分析，筛选出一些显著性差异的代谢物。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

Agilent 5977A/7890B 气相色谱-质谱仪(美国，安捷伦公司)；IKA MS3型迷你振荡器(中国，艾卡广州仪器设备有限公司)；TG20.5台式高速离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；MD200-2型氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司)；AR124CN电子天平(奥豪斯仪器有限公司)；MILLI-QS超纯水器(美国，Millipore公司)。

BSTFA+TMCS(99∶1,v/v)(美国Sigma公司)；吡啶(无水级，99.8%，美国Aladdin公司)；甲氧胺盐酸盐(美国Sigma公司)；甲醇、乙腈、正庚烷、丙酮(色谱纯,国药集团化学试剂有限公司)；正二十二烷(美国Aladdin公司)。

分析标准品：乳酸、甘氨酸、葡萄糖、核糖(美国Aladdin公司)，缬氨酸、丝氨酸、亮氨酸、甘露糖(美国sigma公司)。

1.2 色谱分离条件

色谱柱：HP-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样口温度：250℃；载气：高纯氦气，流速为1.0 ml/min；进样量：1.0 μl，分流进样(分流比为2∶1)；升温程序：70℃保持4 min，以8℃/min升至280℃，保持15 min。

1.3 质谱条件

电离方式：EI(70 eV)；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；采集方式：全扫描(35～800 m/z)；溶剂延迟时间：5.3 min。

1.4 血清样品前处理方法选择

血清样品基质较为复杂，为了获得血清样品中更多内源性代谢物的信息，本实验考察了甲醇、丙酮和乙腈对血清样品中代谢物的提取效果，结果表明，甲醇溶剂的提取效果更好。因此本实验选择甲醇溶剂作为血清样品的提取溶剂。

1.5 样品采集及前处理

采集41例乳腺癌女性患者血清样本，所采集的患者符合以下标准：经病理组织学诊断证实罹患乳腺癌，患者在采集前未接受任何药物或手术治疗，无其他癌症病史。采集20例健康对照组血清样本，所采集者符合以下标准：乳腺检查正常，无乳腺癌病史及其它癌症病史。采集晨起静脉血2 ml，于4000 r/min离心20 min，取其上清液，样品存于-80℃超低温冰箱备用。

取100 μl血清于1.5 ml离心管中，加入400 μl甲醇，涡旋1 min，混合均匀，14000 r/min离心15 min。取上清液150 μL，在温和的氮气流下蒸发至近干，然后加入50 μL甲氧胺吡啶溶液(20 mg/mL)，于烘箱中60℃反应1 h。反应结束后，冷却至室温，加入100 μL BSTFA+TMCS(99∶1,v/v)，于60℃反应1 h后，加入150 μL正庚烷(含0.1 g/L正二十二烷，正二十二烷为内标物质)，终止反应。衍生完成后进行气相色谱-质谱分析。

1.6 数据分析

采用随机森林算法(RF)对血清样本的数据进行分析处理。

2 结果

2.1 色谱分离条件的优化

本实验考察了血清样品在3种升温程序下的分离效果，依据色谱峰的数量以及组分的分离效率，本实验选择了第2个升温程序。血清样品的色谱图如图1所示，获得了二十多个峰，分离效果较好。

图1 乳腺癌血清样本的色谱分离图

实验分别考察了下列3种升温程序下组分的分离情况:(1)60℃保持5 min，15℃/min升至300℃，保持10 min；(2)70℃保持4 min，以8℃/min升至280℃，保持15 min；(3)70℃保持5 min，以4℃/min升至280℃，保持10 min；

2.2 血清样本分析

本实验采集了健康对照组个体样本20例，乳腺癌Ⅱ期患者样本12例，乳腺癌Ⅲ期患者样本29例，在优化的实验条件下对血清样品进行分析，通过用NIST数据库和标准化合物鉴定得到24个共同峰。本实验用正二十二烷作为内标物质，以代谢物的峰面积(Ax)与内标物的峰面积(Ai)比值的形式表示定量结果。最后，成功鉴定了24个共同峰，定性和定量分析结果见表1。

表1 血清中24个色谱共有峰分析结果

2.3 实验数据分析

采用RF对乳腺癌Ⅱ期组、乳腺癌Ⅲ期组及健康对照组样本的数据进行分析，结果如图2所示，3组样本间的差异明显，乳腺癌Ⅱ期组、乳腺癌Ⅲ期组及健康对照组可以被有效地区分开，其中2组乳腺癌组样本与健康组样本距离较远，乳腺癌Ⅱ期组样本靠近乳腺癌Ⅲ期组样本。

图2 3组样本的随机森林算法分析结果

2.4 潜在差异性标志物的筛选

图3列出了该分类模型的代谢物的变量重要度，结果表明，在乳腺癌组样本和健康组样本中具有明显差异的代谢产物主要有：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、1-棕榈酸单甘油酯。

图3 各代谢产物的变量重要度

3 讨论

本文应用气相色谱-质谱法，通过对乳腺癌患者和健康志愿者血清样本进行分析，建立了乳腺癌血清代谢指纹图谱。采用随机森林算法(RF)对血清样本的数据进行了分析处理。随机森林算法(RF)最初是由Breiman在2001年提出的，由于其可以有效地区分不同组样本之间的差异，因此得到了广泛的应用[5]。RF是一种受监督的机器学习分类器，与其他算法相比，它具有良好的性能并具有很大的优势。RF可以用于高维数据的处理(许多特征数据)，并且不需要进行特征选择。与其他分类模型相比，它对分类结果的偏倚估计值低，这使得随机森林算法可应用于许多研究领域。对于组间样本差异，随机森林算法可以有效地进行区分。随机森林算法可以根据各代谢物对分类的贡献程度，得到相应的变量重要度信息，对分类贡献程度大的变量可作为潜在的标志物。

我们应用随机森林算法对实验数据进行统计分析，对潜在的差异性标志物进行了筛选，共筛选出4种具有明显差异的代谢物：肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、1-棕榈酸单甘油酯。棕榈酸，又被称为十六烷酸，是动植物及微生物中最常见的饱和脂肪酸之一。人体内过量的碳水化合物会通过转化，成为棕榈酸，而在脂肪酸合成过程中，棕榈酸是其生成的第一种脂肪酸，它也是较长脂肪酸的前体，由它可以生成更长的脂肪酸。硬脂酸，又称十八烷酸，属于长链脂肪酸。1-棕榈酸单甘油酯是单酰基甘油酯，是由一个通过酯键与甘油分子共价键合的脂肪酸链组成的甘油酯。单酰基甘油脂肪酶对其进行分解，将单酰基甘油酯转化为游离脂肪酸和甘油。肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸这三种代谢物都是饱和脂肪酸。脂肪酸是人体中主要的能量来源。生物细胞膜也是由脂肪酸组成的。脂肪酸贮存于人体的脂肪细胞中，以备不时之需。当人感到饥饿时，脂肪酸在细胞的线粒体内进行氧化分解，释放出大量能量。同时它可以维持细胞膜的相对流动性，从而确保细胞的正常生理活动。脂肪酸在许多代谢途径中起着关键作用，脂肪酸代谢又称为β-氧化，在新陈代谢的过程中会生成乙酰辅酶A，然后进入柠檬酸循环。当人体需要ATP时，可以通过脂肪酸代谢的增加来生成ATP，而脂肪酸代谢的本质就是脂肪酸合成的逆反应。乳腺癌患者血清中这三种脂肪酸水平显著降低，这可能是乳腺癌发展过程中大量的能量消耗所造成的[6]。这些脂肪酸的水平变化可能反映了乳腺癌在发展过程中发生的潜在代谢变化，引起脂肪酸代谢紊乱[7]。

肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、1-棕榈酸单甘油酯的显著性差异变化反映了乳腺癌的发生发展，其会引起脂肪酸代谢紊乱，有可能成为潜在的乳腺癌标志物，为乳腺癌的早期诊断提供了新的方法。