孙国庆 郑保良 胡耀宇

最近的统计数据表明中国前列腺癌发病率逐年上升，有可能成为威胁男性健康的最主要杀手[1-3]。目前虽然有多种前列腺癌治疗方案，包括手术切除、去势、放化疗以及其他姑息疗法，但是其5年生存率尚不能达到理想水平[3-6]。前列腺癌的转移常发生于骨、肺等器官[7-9]，已有大量研究表明其转移与多种信号和分子相关[7]，但是关于其转移发生的决定性机制并没有定论。近年的研究表明淀粉样前体蛋白(APP)在肿瘤的血行转移中具有重要作用[10-11]，当在肿瘤细胞中过表达APP后，肿瘤细胞转移能力显著上升[12-14]。与此同时，在宫颈癌，前列腺癌以及结肠癌和胰腺癌患者的癌症组织中也检测到APP的显著高表达，且患者预后与APP的表达呈负相关[15-17]。但是在肿瘤组织中，APP为什么呈高表达并无研究报道，了解其上调表达可能有助于寻找肿瘤治疗的新靶点。已有大量研究表明TGF β在多种肿瘤的发生、发展、转移和免疫逃逸中具有重要意义[18-20]。一方面，TGF β可以通过促进T细胞分化为Treg细胞，从而抑制肿瘤免疫的发生[21-23]；另一方面，TGF β也可以通过促进肿瘤细胞中多种基因的表达从而促进肿瘤细胞的迁移[24-26]，但是目前尚无研究表明TGF β与前列腺癌细胞APP的表达之间具有相关性，因此本研究旨在证实APP与TGF β诱导的前列腺癌细胞迁移和侵袭的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

前列腺癌PC-3细胞株购自中国医学科学院肿瘤医院；RPMI 1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司；total RNA提取试剂盒购自碧云天试剂公司；逆转录试剂盒和SYBR购自TAKARA公司；β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad兔抗人一抗和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗购自CST；TGF β购自Protein tech公司；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自碧云天；引物由上海生工合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和实验分组 前列腺癌PC-3细胞培养于含有10%胎牛血清和1%双抗的DMEM-F12完全培养基中，置于37℃，含有5%的CO2细胞孵育箱，培养2～3天待密度达到90%时1∶3传代。

1.2.2 细胞迁移和侵袭检测 参照TGF β在其他癌细胞的研究中方法设计实验，细胞以1×105个/孔的密度接种至24孔板之后，适应生长24 h更换培养基，待细胞生长至对数生长期，加入20 ng/ml的TGF β处理48 h[27-28]，收集并用基础培养基重悬细胞，添加至Transwell迁移小室上腔，下腔加入FBS终浓度为6%的含血清培养基。上下腔组合完整，继续培养3 h。终止迁移后取出上腔，用棉签除去聚碳酸酯膜内壁未迁移细胞，晾干后用终浓度为0.1%的结晶紫染液于37 ℃染色15 min，取出再次晾干后于倒置显微镜下观察计数并拍照。

侵袭实验：Transwell迁移小室上腔预先添加基质胶溶液，待基质胶沉积于碳酸酯膜之后吸弃废液，如上所述重悬细胞后加入上腔，继续培养24 h并如上染色并拍照。

1.2.3 实时荧光定量PCR实验 处于对数生长期细胞消化重悬后，以每孔5×105个的密度接种到6孔板中，保证密度在40%左右，培养过夜后，依照试剂盒说明书提取细胞总RNA，检测浓度后按照试剂盒说明书经逆转录构建cDNA，程序为 37 ℃孵育15 min，85 ℃反应5 sec，反应结束保存于4 ℃。随后按照试剂盒说明书进行qPCR反应，程序为95 ℃预变性15 sec；95 ℃变性5 sec，62 ℃退火30 sec，进行40个循环。结果以β actin为内参，通过2-△△ct计算相对表达量。引物序列如下所述：β actin上游：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT；下游：GCTGTCACCTTCACCGTTCC。APP上游：CAAGCAGTGCAAGACCCATC；下游：AGAAGG-GCATCACTTACAAACTC。

1.2.4 蛋白印迹实验 处于对数生长期细胞消化重悬后，以每孔5×105个的密度接种到6孔板中，保证密度在40%左右，适应培养过夜后，提取细胞总蛋白，使用BCA法检测总蛋白浓度，加入相应体积的上样缓冲液并煮沸5 min后冻存于-20℃。配制SDS-PAGE凝胶后对上述样本进行电泳分离，转移至PVDF膜上，5% BSA室温封闭2 h，添加β actin、APP、p-Smad 1、p-Smad 2、smad稀释的一抗，4℃孵育过夜，TBST清洗，添加已经稀释的HRP-IgG二抗，室温孵育2 h，TBST清洗后使用发光液进行曝光，以β actin作为内参，统计相应蛋白的相对表达量。

1.3 统计方法

所有的统计数据以均数±标准差表示，两组间比较在SPSS 21.0软件中使用双尾t检验进行差异性统计，多组间两两比较使用单因素方差分析进行统计，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TGF β对前列腺癌细胞迁移和侵袭的作用

前列腺癌细胞常规培养后，使用相应浓度的TGF β处理细胞，通过迁移小室检测TGF β对前列腺癌PC-3细胞迁移、侵袭能力的影响。结果如图1、图2所示，20 ng/ml的TGFβ能显著提升肿瘤细胞的迁移能力，即增加了细胞跨膜迁移侵袭的数目(P<0.05)。

注：*表示P<0.05，差异具有统计学意义。

注：*表示P<0.05，差异具有统计学意义。

2.2 TGF β通过Smad途径对APP表达的促进作用

前列腺癌细胞常规培养后，使用相应浓度的TGF β处理细胞，提取总蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳检测TGF β对Smad信号通路相关分子活化水平的影响。结果如图3所示，20 ng/ml的TGF β显著提升肿瘤细胞Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)。 前列腺癌细胞常规培养后，使用相应浓度的TGF β处理细胞，提取总蛋白和总RNA后进行SDS-PAGE凝胶电泳和qPCR检测，结果如图4所示，无论在转录水平还是翻译水平，20 ng/ml的TGF β都显著提升肿瘤细胞APP的表达(P<0.05)。

注：A为凝胶电泳图；B为蛋白印迹灰度值的统计结果。*表示P<0.05，差异具有统计学意义。

注：A为凝胶电泳图；B为蛋白印迹灰度值的统计结果；C为qPCR检测细胞的相对基因含量的统计结果。*表示P<0.05，差异具有统计学意义。

2.3 LY2109761对TGFβ/Smad途径诱导的APP表达的抑制作用

前列腺癌细胞常规培养后，使用相应浓度的TGF β处理细胞，提取总蛋白和总RNA后进行SDS-PAGE凝胶电泳和qPCR检测TGF β对Smad信号通路相关分子活化水平以及APP表达水平的影响。结果如图5所示，Smad抑制剂LY2109761能够逆转TGF β的生物学效应，即降低Smad 1和Smad 2的磷酸化水平(P<0.05)，并下调APP的表达(P<0.05)。

注：A为SPS-PAGE凝胶电泳图；B为蛋白印迹灰度值的统计结果；C为qPCR检测各组细胞的相对基因含量的统计结果。*表示与对照组相比，P<0.05，差异具有统计学意义；#表示与TGF β处理组相比，P<0.05，差异具有统计学意义。

2.4 APP表达对PC-3细胞的迁移和侵袭的影响

采用TGF β/Smad前列腺癌细胞常规培养后，使用相应浓度的TGF β处理细胞，同时使用Smad抑制剂LY2109761处理细胞控制细胞内APP的表达，通过迁移小室检测TGF β或TGF β+Smad抑制剂对前列腺癌PC-3细胞迁移和侵袭能力的影响。结果如图6所示，APP表达高的组别其迁移和侵袭能力明显高于对照组(P<0.05)，而在对APP表达加以抑制后，细胞的迁移侵袭能力明显下降(P<0.05)。

注：A为各组细胞的迁移能力；B为迁移各组细胞的侵袭能力；C为迁移实验的统计结果。D为侵袭实验的统计结果。*表示与对照组相比，P<0.05，差异具有统计学意义；#表示与TGF β处理组相比，P<0.05，差异具有统计学意义。

3 讨论

前列腺癌的转移一直是其治疗的难点，也是肿瘤患者生存率不佳的主要原因[1,27-28]。前列腺癌的转移与多种因素相关[1,4]，但是目前尚无定论，因此深入研究其转移的机制有助于找到新的治疗靶点。

APP是近年发现的一个促进肿瘤转移的细胞膜蛋白，在多种肿瘤组织中显著高表达[14-16]。TGF β与多种肿瘤的转移相关[21,24]，然而TGFβ在前列腺癌中的机制尚未清楚。本研究通过迁移小室实验初步证实TGF β能够促进前列腺癌PC-3细胞的迁移和侵袭。在进一步研究中，发现TGF β能够在转录和翻译水平显著上调APP的表达水平，且对此效应产生的APP表达的抑制能够明显降低细胞的迁移和侵袭水平。这提示TGF β可能通过上调APP的表达水平产生上述效应。

研究表明，Smad 1和Smad 2磷酸化后处于激活状态，能够移位入核影响下游靶基因的转录[29-31]，并以此调控细胞的生物学功能。在对TGF β对前列腺癌影响的机制研究中，本研究检测了TGF β下游分子Smad 1和Smad 2的磷酸化水平，结果发现TGF β显著上调了Smad 1和Smad 2的磷酸化，从而促进其入核并调节其下游的基因APP的表达。当使用Smad 抑制剂LY2109761处理后，发现此途径引起的APP表达也受到抑制，迁移小室证实细胞的迁移和侵袭能力也随之减弱，这说明APP的表达与前列腺癌细胞的侵袭和迁移能力密切相关。

尽管如此，本实验仍然存在缺陷。本实验采用的APP表达抑制方法存在缺陷，只能够通过抑制TGF β/Smad通路途径实现，这会使得此通路下游的各种蛋白情况均受到影响，对实验造成干扰。关于APP在前列腺癌中的作用仍然存在争议。BCR survival图显示APP在前列腺癌中起抑癌作用，与本文结果相反。这可能是由于本次实验采取的APP抑制方法导致了其他一些蛋白的抑制，从而对实验结果产生了干扰。本文仅探讨了APP对前列腺癌细胞增殖迁移的影响，不能完全反映APP在癌细胞中的其他作用。此外，本次实验结果是在体外条件得到的，在体内前列腺癌细胞的增殖和迁移还受到各种因素的调节，因此APP对机体内癌细胞的作用还需要进一步探讨。

总体而言，本研究初步证实TGF β/Smad通路能够使得前列腺癌细胞中的APP水平上调，并可能通过此途径促进前列腺癌细胞的迁移和侵袭，APP很可能是前列腺转移抑制的新靶点。