马佳 彭献 何樨

【摘要】目的：調查孤独症谱系障碍 ASD 患儿肠道菌群失衡、免疫指标紊乱情况，并分析其相关性，为临床解释 ASD 病因机制提供可靠依据。方法：选取2017年6月至2020年6月期间于我院门诊确诊的82例 ASD 患儿为观察组，并随机选取同期接受健康体检57例儿童作为健康对照组，采集两组儿童粪便，通过荧光定量 PCR 法测定其肠道菌群多样性，定量检测并计算其双歧杆菌属细菌数量与肠杆菌科细菌数量对数值比值 B/E 值，比较两组儿童肠道菌群数量、B/E 值及免疫指标（白细胞介素-5）IL-5、巨噬细胞炎性蛋白1α（MIP-1α）、调节性 T 细胞（Treg）、促炎辅助性 T 细胞17型 （Th17）、Treg/Th17水平，并通过 Pearson 积矩相关分析评估 ASD 患儿 B/E 值与 IL-5、MIP-1α、Treg、Th17、Treg/ Th17指标间相关性。结果：两组对象性别、年龄、母亲文化水平、孕期抗生素使用比较无统计学意义（P>0.05），两组父亲文化水平、分娩方式、新生儿窒息资料比较有统计学意义（P<0.05）;观察组大肠埃希菌、双歧杆菌数量及 B/E 值明显低于健康对照组（P<0.05），两组肠球菌、乳酸杆菌数量比较无统计学意义（P>0.05）;观察组 MIP-1α、Treg、Treg/ Th17明显低于健康对照组（P<0.05），而 IL-5、Th17明显高于健康对照组（P<0.05）;经 Pearson 相关分析，ASD 患儿B/E 值与 IL-5、MIP-1α均无相关性（P>0.05），与 Treg、Treg/Th17均具有正相关性（P<0.05），与 Th17具有负相关（P<0.05）。结论： ASD 患儿体内确存在肠道菌群失衡情况，并伴随着免疫指标紊乱，且两者具有一定相关性。

【关键词】孤独症谱系障碍;现状调查;相关因素;免疫指标;肠道菌群

[中图分类号]R574;R749.94 [文献标识码]A[文章编号]2096-5249（2022）01-0081-04

Investigation and relationship analysis of intestinal flora imbalance and immune index disorder in children with ASD

MA Jia， PENG Xian， HE Xi （Department ofPreventionandProtection， Futian Second People’s Hospital， Shenzhen Guangzhou 518049，China）

[Abstract] Objective： To investigate the imbalance of intestinal flora and disorder of immune indexes in children with ASD in autism spectrum disorder， and analyze their correlation， so as to provide reliable basis for clinical explanation of the etiology and mechanism of ASD. Methods： Eighty-two children with ASD diagnosed in the outpatient department of our hospital from June 2017 to June 2020 were selected as the observation group， and 57 children who received physical examination at the same time were randomly selected as the healthy control group. The feces of the two groups of children were collected， the diversity of intestinal flora was determined by fluorescence quantitative PCR， and the ratio of the number of Bifidobacterium bacteria to the number of Enterobacteriaceae bacteria was quantitatively detected and calculated by B/E value. The intestinal microflora， B/E value and immune indexes （Interleukin -5） IL-5， macrophage inflammatory protein 1α（MIP-1α）， regulatory T cells （Treg）， pro-inflammatory helper T cells type 17（Th17）， Treg/Th17 were compared between the two groups， and the B/ T ratio of children with ASD was evaluated by Pearson product moment correlation analysis. Results： There was no significant difference in sex， age， mother’s educational level and antibiotic use during pregnancy between the two groups （P>0.05）， but there was significant difference in father’s educational level， mode of delivery and neonatal asphyxia between the two groups （P<0.05）. The number and B/E value of Escherichia coli and Bifidobacterium in observation group were significantly lower than those in healthy control group （P<0.05）， but there was no significant difference in the number of enterococcus and lactobacillus between the two groups （P>0.05）. MIP-1α， Treg and Treg/Th17 in the observation group were significantly lower than those in the healthy control group （P<0.05）， while IL-5 and Th17 were significantly higher than those in the healthy control group （P<0.05）. Pearson correlation analysis showed that the B/E value of ASD children was not correlated with IL-5 and MIP-1α（P>0.05）， but positively correlated with Treg and Treg/Th17（P<0.05） and negatively correlated with Th17（P<0.05）. Conclusion： There is an imbalance of intestinal flora in children with ASD， accompanied by disorder of immune indexes， and there is a certain correlation between them.

[Key words] Autism spectrum disorder; Current situation investigation; Related factors; Immune indicators; Intestinal flora

孤独症谱系障碍（Autistic Spectrum Disorder， ASD）属于临床广泛意义上孤独症，不仅包含典型孤独症，还包含不典型孤独症及以阿斯伯格综合症为代表疑似症状，与自闭症同义，是一组以社交沟通障碍、兴趣或活动范围狭窄以及重复刻板行为主要特征神经发育障碍[1]。目前，临床针对 ASD 患儿发病机制及危险因素尚无统一定论，可能与遗传学、免疫、生化、孕产期等因素有关[2]。以往研究针对ASD 患儿肠道微生物多样性调查报道较多，但对其与免疫系统相互影响机制尚未明确，本研究选取临床较为常见免疫指标，旨在探究 ASD 患儿肠道菌群失衡、免疫指标紊乱情况，并分析其相关性，为相关部门制定ASD 预防、监测、康复等方面政策提供科学依据。

1 资料与方法

1.1研究对象选取2017年6月至2020年6月期间于我院门诊确诊82例 ASD 患儿为观察组，年龄1～6岁，平均年龄（3.23±1.32）岁，纳入标准：符合美国精神病学会发布精神疾病诊断统计手册第五版[3]中 ASD 诊断标准者;孤独症儿童行为量表 ABC ≥67分者;初次确诊为 ASD 者;患儿及其家属知情同意，并主动提出签署知情同意书。排除标准：听力障碍、脑部发育障碍者;合并脆性 X 综合征、精神发育异常、阿思伯格综合征等精神疾病者;神经发育迟缓无法完成调查者;合并先天性疾病者;近期存在急性或慢性感染史者。并随机选取同期接受健康体检57例儿童作为健康对照组，本次研究得到医学伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1调查方法采用 ABC 量表进行初次筛选，该量表适用于18个月～28岁人群，可归纳为感觉、交往、躯体运动、语言、生活自理五个维度，共57 个条目，总分为158分，将得分≥67分患儿归为可疑患儿，并参照精神疾病诊断统计手册第五版诊断标准确诊。由我院儿童心理卫生科自编背景问卷发放调查，由其主要监护人进行填写。

1.2.2肠道菌群多样性检测方法所有儿童均于入院当天收集其新鲜粪便标本5 g，放于含有保存液培养盒中，并置于-80℃冰箱内保存。通过QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit/Qiagen 粪便 DNA 快速提取试剂盒德国凯杰 QIAGEN 公司提取样本核酸，并进行浓度、纯度等分析，利用1.2%琼脂糖凝胶电泳进行完整性质检。对提取完整核酸进行目的片段16 S rDNA V3 V4 d 的 PCR 扩增，其引物基因序列见表1。以扩增产物为模板，通过 Illumina MiSeq测序文库进行标签序列添加，全部产物采用Axygen DNA 凝胶回收试剂盒 AP-GX-50爱思进生物技术有限公司进行回收，实时 PCR 进行荧光定量分析，均一混合后完成文库制备，利用 PE300测序系统进行高通量测序。

1.2.3免疫指标检测方法于清晨空腹下行常规静脉采血5 mL 置于抗凝管，经Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个核细胞 PBMC，并制备血浆，以3000 r/min 离心血样10 min，提取血清并于 -70℃条件下保存待测;通过CytoFLEX LX 流式细胞仪贝克曼库尔特商贸有限公司检测辅助性 T 细胞、调节性 T 细胞水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附法试剂盒上海臻科生物科技有限公司测定患儿白细胞介素-5、巨噬细胞炎性蛋白1 α水平，所有试剂盒操作均严格按照试剂盒自带说明书进行。

1.3观察指标比较两组儿童肠道菌群数量、 B/E 值及免疫指标 IL-5、MIP -1 α、Treg、Th17、 Treg/Th17水平，并通过 Pearson 积矩相关分析评估ASD 患儿 B/E 值与 IL-5、MIP -1 α、Treg、Th17、 Treg/Th17指标间相关性。

1.4统计学方法采用 SPSS18.0统计学软件分析数据，计数资料以率%表示，组间对比进行χ2检验，计量资料用x ±s 表示，多组间采用单因素方差分析，统计学有意义结果进一步采用 SNK-q 检验;相关性采用 Pearson 分析法，以P<0.05时为差异有统计学意义。

2 结果

2.1两组一般资料比较选取2017年6月至2020年6月期间于我院門诊确诊82例 ASD 患儿为观察组，另选57例患儿为健康对照组，其两组一般资料对比如表2所示。

2.2两组肠道微生物多样性比较观察组大肠埃希菌、双歧杆菌数量及 B/E 值明显低于健康对照组（P<0.05），两组肠球菌、乳酸杆菌数量比较无统计学意义（P>0.05），详见表3。

2.3两组免疫指标比较观察组 MIP -1 α、 Treg、Treg/Th17明显低于健康对照组（P<0.05），而IL -5、Th17明显高于健康对照组（P<0.05），详见表4。

2.4 ASD 患儿 B/E 值与 IL-5、MIP-1α、Treg、 Th17、Treg/Th17相关性分析经 Pearson 相关分析，ASD 患儿 B/E 值与 IL -5、MIP -1α均无相关性（P>0.05），与 Treg、Treg/Th17均具有正相关性（P<0.05），与 Th17具有负相关（P<0.05），详见表5。

3 讨论

孤独症概念由利奥·凯纳Kanner·L教授首次提出，随后得到广泛关注与报道，在2013年5月精神疾病诊断统计手册第五版中最终确立 ASD 定义，使该病介绍更加普及[4]。

以往研究表明，ASD 属于一种因神经系统失调而引发发育障碍，其临床多伴随胃肠道问题及免疫功能紊乱，临床针对 ASD 患儿微生物数量及其多样性调查较多，但与免疫功能指标关系报道较少。本研究通过调查 ASD 患儿与健康同龄儿童肠道菌群失衡情况，结果显示，观察组大肠埃希菌、双歧杆菌数量及 B/E 值明显低于健康对照组，提示 ASD 患儿发病确伴有肠道菌群失调状况，分析原因，脑-肠-菌轴作为胃肠道与神经系统间联系，主要涉及中枢神经系统、自主神经系统、肠道菌群、肠神经系统等，其中神经系統可通过信号传导等对肠道发挥抑制作用，而过度激活则会导致肠道运动障碍，并影响其分泌功能。肠道菌群与 ASD 确有关联，但具体作用机制尚不清楚。

王琳等[5]还发现，ASD 儿童存在明显神经免疫异常，表现出骨桥蛋白及白介素17A 水平异常升高。本研究选取较为常见几类指标，其中 MIP-1α属于CC 类趋化因子，主要通过趋化 T 淋巴细胞等在炎症区域或肿瘤部位发挥促炎作用。IL-5主要由抗原活化 CD4+T 细胞产生，并具有诱导 B 细胞及嗜酸性粒细胞分化、促进细胞毒 T 细胞生成等作用[6]。Th17细胞因子与 Treg 细胞因子之间表现为功能相互拮抗关系，在 ASD 疾病发展中，Th17呈现出强促炎、诱导自身免疫疾病作用，Treg 则表现为抗炎、调控免疫应答作用[7]。研究结果显示，观察组 MIP -1α、 Treg、Treg/Th17明显低于健康对照组，而 IL -5、 Th17明显高于健康对照组，表明 ASD 患儿存在一定免疫障碍。Th17及其相关细胞因子数量占优势，表明 ASD 患儿全身或局部免疫应答异常。结果中 ASD患儿表现出 MIP-1α水平降低，与以往部分研究结果不符，可能是因为纳入标准不一样所致[8]。该结果产生可能与其代谢产物的抗炎作用降低有关，进而引发免疫耐受异常，另外，ASD 患儿肠粘膜损伤，增加细菌、大分子抗原等入侵风险，出现局部炎症反应，影响其免疫功能紊乱。

综上所述，ASD 患儿体内确存在肠道菌群失衡情况，并伴随着免疫指标紊乱，且两者具有一定相关性。

参考文献

[1] 赵英欣 ， 张旭静 ， 郑毅 . 肠道微生物 - 大脑轴与孤独症谱系障碍 [J]. 中华精神科杂志 ， 2019， 52（3）： 224-227.

[2] 王琳 ， 杨晓蕾 ， 马永娟 ， 等 . 神经免疫指标与孤独症谱系障碍的关联 [J]. 中国学校卫生 ， 2019， 40（4）： 499-502.

[3] 王雷 ， 赵会君 ， 罗茜 ， 等 . 不同碳水化合物对孤独症患儿肠道菌群体外发酵产生短链脂肪酸的影响 [J]. 中国微生态学杂志 ， 2019， 31（5）： 512-518.

[4] 张静 ， 王凯旋 ， 盛放 ， 等 . 维生素 D 对孤独症谱系障碍儿童血清 25（OH）D 水平肠道症状及肠道菌群失调的影响[J]. 中国妇幼保健 ， 2020， 35（23）： 4493-4495.

[5] 王琳 ， 杨晓蕾 ， 马永娟 ， 等 . 神经免疫指标与孤独症谱系障碍的关联 [J]. 中国学校卫生 ， 2019， 40（4）： 499-502.

[6] 肖鸽飞 ， 周翔 ， 李桦 ， 等 . 炎性细胞因子与孤独症谱系障碍儿童精神发育的相关性分析 [J]. 中国儿童保健杂志 ， 2018， 26（7）： 778-780.

[7] 汪鸿 ， 王小燕 ， 吴梅荣 ， 等 . 孤独症谱系障碍儿童外周血淀粉酶样前体蛋白及脑源性生长因子的特异性研究 [J]. 中国儿童保健杂志 ， 2018， 26（10）： 95-98.

[8] 肖鸽飞 ， 周翔 ， 李桦 ， 等 . 炎性细胞因子与孤独症谱系障碍儿童精神发育的相关性分析 [J]. 中国儿童保健杂志 ， 2018， 26（7）： 778-780.

作者简介：马佳，大学本科，副主任医师，研究方向：儿童保健学。

（ 收稿日期：2021-6-21 接受日期：2021-8-12）