马欣蓉，朱晓鸣，李 静，李德利，李和平△，谭建国△

(1.北京大学口腔医学院·口腔医院修复科，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，北京 100081； 2.北京大学口腔医学院·口腔医院第二门诊部，北京 100101； 3.清华大学工程物理系，北京 100084)

牙体缺损是口腔临床常见病和多发病[1]。近年，随着修复理念的更新，牙本质粘接修复理论及仿生再矿化理论成为牙体缺损修复的两大研究热点。基于牙本质自身特点，牙本质胶原纤维的三维结构完整性及良好的理化性能是树脂粘接修复和生物再矿化成功的必要条件[2-5]。各种因素导致牙本质胶原纤维破坏、变性，如基质金属蛋白酶的激活等都会造成粘接耐久性降低[6-7]。研究表明，牙本质胶原纤维的交联度决定了其机械性能和抗酶解性[8]。因此，增强牙本质胶原纤维交联度对改善牙本质粘接耐久性及提高牙本质生物再矿化能力有重要意义。

目前，国内外研究提出的提高牙本质胶原纤维交联度的方法尚存在一定缺陷[9-10]。本课题组先前的研究证实，新型大气压射频辉光放电(radio-frequency atmospheric-pressure glow discharge，RF-APGD)等离子体处理可以在避免损伤脱矿牙本质胶原纤维结构的同时，改善其理化性能，进而提高树脂-牙本质粘接的耐久性[11-12]，但目前尚未见关于新型RF-APGD等离子体处理促进牙本质胶原纤维交联化作用的研究。因此，本研究拟探讨新型RF-APGD等离子体射流处理对脱矿牙本质胶原纤维微观结构、机械性能和交联度的影响，以期促进牙本质胶原纤维交联化，为大气压冷等离子体在口腔领域的应用提供良好的理论依据。

1 资料与方法

1.1 大气压冷等离子体发生装置

选用清华大学工程物理系等离子与健康科技研究组开发的新型RF-APGD等离子体源，该实验装置包括等离子体发生器、电特性和光谱特性测量装置等[13]。产生射频辉光放电等离子体的电源驱动频率为13.56 MHz，放电功率为15 W，等离子体工作气体为高纯氦气，其流速固定为10.8 L/min。放电过程中，等离子体射流的气体温度保持在4 ℃±2 ℃范围内[11]。

1.2 试验材料

于北京大学口腔医院颌面外科收集未萌出、完整、无龋坏的第三磨牙100颗，拔除后置于4 ℃含有0.02%(质量分数)叠氮化钠的生理盐水中，1个月内使用。本研究由北京大学口腔医院伦理委员会审查通过，批准号为PKUSSIRB-201522043，患者均签署知情同意书。

1.3 脱矿牙本质表面形貌及微观结构观测

选取离体牙20颗，采用精密低速切割机(Isomet，Buehler，美国)垂直于牙长轴去除牙釉质，每颗离体牙制备平行于牙合面的中层牙本质薄片1片，厚度为(1.5±0.1) mm。体式显微镜(SMZ 1500，Nikon，日本)下确认牙本质表层无釉质残留。10%(质量分数)H3PO4溶液酸蚀16 h，获得全脱矿牙本质胶原纤维。

1.3.1衰减全反射傅里叶变换红外光谱仪(atte-nuated total reflection-Fourier transform infrared spectroscopy，ATR-FTIR)观测 利用ATR-FTIR(Nicolet iS50，Thermo Scientific，美国)观测牙本质胶原纤维片，扫描范围400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次。

1.3.2扫描电镜观察 乙醇梯度脱水(质量分数为25%的乙醇10 min，50%乙醇10 min，75%乙醇10 min，95%乙醇10 min，100%乙醇30 min×2次)，全自动临界点干燥仪(EM CPD300，Lecia，德国)干燥，喷金，利用场发射扫描电镜(SU8010，Hitachi，日本)观察。

1.3.3透射电镜观察 乙醇梯度脱水(同1.3.2小节)，浸泡于100%(质量分数)环氧丙烷中作为过渡液，然后包埋在环氧树脂中。制备70 nm厚的切片，利用透射电镜(HT7700，Hitachi，日本)在80 kV的条件下观察。

1.4 牙本质胶原纤维交联度测定

选取离体牙40颗，制备标准牙本质片40片，液氮冷冻30 min后研钵研磨获得5 g牙粉。筛选直径<20 μm的牙粉置于10%H3PO4溶液中脱矿5 h，蒸馏水反复离心，吸除多余水分后冷冻干燥。随机分为5个组，对照组无任何处理，实验组分别使用等离子体处理20 s、30 s、40 s、50 s，使用电子天平(AL204，Mettler Toledo，瑞士)称量得到每组2 mg牙本质粉。采用茚三酮溶液处理，离心后取100 μL上清液，分别在酶标仪(Elx808，BioTek，美国)上测其570 nm波长下的光密度值；隔天重复测1次，所有操作均在暗室中进行。同时以甘氨酸系列标准液制作标准曲线，计算其胶原的交联度：交联度(%)=(M0-Mt)/M0×100%。式中M0和Mt分别为等离子体处理前后牙本质粉中自由α-氨基酸的量。

1.5 牙本质胶原极限拉伸强度测定

选取离体牙40颗，每颗牙制备平行于牙合面中层牙本质片1片，再按垂直于牙合面的方向将试件切成条状(1.0 mm×1.0 mm×7.0 mm)。每颗牙只取最中心位置对称的两个牙本质条(n=80)纳入研究，浸泡于10%H3PO4溶液中16 h获得全脱矿牙本质胶原纤维条。将牙本质条随机均分为5组，对照组无任何处理，实验组4组分别采用等离子体处理牙本质胶原纤维条各个轴面20 s、30 s、40 s、50 s后置于万能力学实验仪(EZ-L，Shimadzu，日本)上，以1.0 mm/min的速度进行加载，直至牙本质断裂。分别记录各试件断裂时的最大载荷，并计算其拉伸强度：极限拉伸强度(MPa)=最大载荷(N)/试件横截面积(mm2)。测试过程中保持试件湿润。

1.6 统计学分析

计量数据以均数±标准差表示，茚三酮实验及极限拉伸强度结果采用统计软件SPSS 21.0(IBM，美国)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，比较各组交联度及极限拉伸强度均值的差异，采用Bonferroni法进行多重比较，均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 牙本质胶原纤维表面形貌

扫描电镜观察发现，对照组脱矿牙本质表面胶原纤维连续，三维结构完整，呈现立体蓬松的均匀多孔表面形貌，表层及表层下方胶原纤维粗细较为均匀，交织成网(图1A)。等离子体处理20 s、30 s及40 s后，表层胶原纤维无坍塌变形，胶原纤维结构舒展、连续，胶原全层均匀多孔，与对照组无明显差异(图1B、C、D)；处理50 s后，部分胶原纤维不连续、发生断裂，但仍能维持蓬松网状结构(图1E)。

A, control; B, 20 s; C, 30 s; D 40 s; E, 50 s.图1 对照组及新型RF-APGD等离子体处理组牙本质胶原纤维扫描电镜结果Figure 1 Typical field emission scanning electron micrographs of the untreated dentin collagen and the dentin collagen treated by the RF-APGD plasma jet for different times

2.2 牙本质胶原纤维超微结构

透射电镜观察发现，对照组中胶原纤维间存在空隙，结构为蓬松状态，具有天然Ⅰ型胶原典型的67 nm周期性条带结构(图2A)。等离子体处理20 s、30 s及40 s，仍可以发现呈条纹状相连的胶原纤维及胶原纤维松散排列，其间有明显空隙(图2B、C、D)，与对照组超微结构无明显差异。处理50 s后部分胶原纤维结构破坏(图2E)。

A, control, 67 nm periodic transverse pattern of natural type Ⅰ collagen fiber (arrow); B, 20 s; C, 30 s; D 40 s; E, 50 s.图2 对照组及新型RF-APGD等离子体处理组牙本质胶原纤维透射电镜结果Figure 2 Transmission electron micrographs of the untreated dentin collagen and the dentin collagen treated by the RF-APGD plasma jet for different times

2.3 牙本质胶原纤维二级构象及交联反应

图3 对照组及新型RF-APGD等离子体处理组牙本质胶原纤维红外光谱结果Figure 3 ATR-FTIR spectra of the untreated dentin collagen and the dentin collagen treated by the RF-APGD plasma jet for different times

2.4 牙本质胶原交联度

等离子体处理30 s组和40 s组胶原的交联度分别为(60.25%±2.50%)和(48.52%±7.88%)，均高于其余各组，且差异有统计学意义(P<0.05)，其中30 s组高于40 s组。处理20 s组胶原的交联度(19.41%±8.28%)高于处理50 s组(5.03%±5.76%)，二组差异有统计学意义(P<0.05)。所有处理组均较对照组交联度更高(图4)。

2.5 牙本质胶原纤维极限拉伸强度

等离子体处理组和对照组的极限拉伸强度见表1。对照组所获得的极限拉伸强度为(1.67±0.24) MPa，等离子体处理20～40 s组极限拉伸强度随处理时间增加而增加，50 s组稍有下降，但其极限拉伸强度仍高于对照组。其中，等离子体处理30 s及40 s后所获得的极限拉伸强度为(7.06±0.30) MPa和(7.32±0.27) MPa，较对照组提高了320%和338%，差异有统计学意义(P<0.05)。

表1 对照组及新型RF-APGD等离子体处理组牙本质胶原纤维极限拉伸结果Table 1 A comparison of the ultimate tensile strength values of the untreated dentin and the dentin collagen treated by the RF-APGD plasma jet for different times

3 讨论

牙本质是一个富含矿化胶原和水的复杂结构，其中无机矿物质占体积的50%，有机物(主要为Ⅰ型胶原纤维)占30%，水占20%[14]。牙本质发生病理性龋坏时，牙本质基质无机物脱矿，形成以胶原纤维为主的有机结构。基于微创修复的牙科理念，利用牙本质粘接修复或生物再矿化最终恢复牙本质硬组织形态及功能完整性的修复手段越来越受到重视。其中，牙本质粘接修复仍是临床中处理牙体硬组织缺损的主要修复方式[15]。牙本质“混合层”理论被认为是实现理想牙本质粘接强度的基础[3]，其中纳米微结构的胶原纤维网是形成混合层的关键条件，但受树脂渐进性渗透的影响，混合层底部仍然存在裸露和部分脱矿的胶原区域，相较于正常牙本质基质，脱矿牙本质胶原纤维机械性能下降并且酶解易感性增强，降低了牙本质粘接修复的耐久性。另外，近年来仿生矿化的牙体硬组织修复方式日益兴起，其处理可在局部形成类似天然组织的结构，对牙体缺损的恢复具有重要意义[16]。研究证实，良好的胶原纤维三维结构可以为再矿化提供框架和空间制约，是引导无定形磷酸钙晶体附着、排列和生长的前提，从而使牙本质胶原纤维内外部均能受到矿物质保护，防止外界刺激导致其变性降解[17]。因此，无论是牙本质粘接还是仿生矿化修复方式，牙本质胶原纤维的三维结构及良好自身性能对于能否形成完整的混合层及促进牙本质再矿化均至关重要[4]。

Different letters indicate that the difference between groups is statistically significant (P<0.05).图4 新型RF-APGD等离子体处理组牙本质胶原纤维交联度结果Figure 4 Crosslinking ratio of the dentin collagen treated by the RF-APGD plasma jet for different times

研究发现，促进牙本质胶原纤维交联化是提高其自身强度，维持和稳定胶原纤维网状结构的有效解决途径，且牙本质胶原纤维交联度的增高能在一定程度上抵抗基质金属蛋白酶和半胱氨酸酶降解。大气压冷等离子体被视为一种新型的、“清洁”的处理方法，能够产生许多活性氧和活性氮基团及电子、离子和紫外线等，已被广泛应用于口腔医学研究领域[18]。本研究中所采用的等离子体在射流粒子活性含量不变的情况下，具有更加温和的能量输出特性，这一特性可以显著降低等离子体射流中活性粒子对牙本质胶原纤维的轰击-蚀刻效应，本研究中的扫描电镜结果也证实了这一点。扫描电镜观察表面形貌发现，等离子体处理20 s、30 s、40 s后，胶原纤维始终能保持蓬松立体的表面形貌(图1B、C、D)，与对照组(图1A)一致，能够良好地维持胶原纤维的三维网状结构。此外，透射电镜结果表明，经等离子体处理不同时间后(图2B、C、D)，胶原纤维间仍存在间隙，表明三维架构良好；并且能观察到天然胶原纤维周期性横纹，表明等离子体处理保持了牙本质胶原纤维超微螺旋结构的完整性。采用ATR-FTIR进行牙本质胶原结构分析，进一步印证了透射电镜观察结果，发现经等离子体处理后(图3)，牙本质胶原中的特征峰位置没有改变，说明等离子体处理仅改变了胶原的表面性质而没有破坏其内部结构。因此，等离子体处理对维持牙本质胶原纤维良好三维结构及保持超微结构具有重要意义。

除化学交联外，高密度的电子和自由基还可以破坏键，在胶原表面产生“活性位点”，进而产生共价交联，发生物理交联反应，从而不可逆转地增加胶原的硬度和强度。本研究中透射电镜结果表明，等离子处理30 s及40 s后(图2B、C)，天然牙本质胶原纤维周期性横纹未发生明显变化，但胶原纤维更加致密有序，空隙较无处理组减小，间接表明牙本质胶原纤维间发生物理共价交联，这一结果与牙本质胶原纤维极限拉伸强度结果相呼应。等离子体处理30 s及40 s后所获得的极限拉伸强度为(7.06±0.39) MPa和(7.32±0.27) MPa，较对照组提高了320%和338%，差异有统计学意义(P<0.05)。因此，等离子体处理可以有效增加胶原纤维自身强度。

综上所述，本研究发现新型RD-APDG等离子体处理30 s和40 s在保持牙本质胶原结构不变的同时，可以对牙本质胶原纤维进行改性，促进其交联反应的发生。因此，采用新型RF-APGD等离子体处理牙本质胶原纤维，为实现牙本质再矿化和良好的牙本质粘接耐久性提供了广阔的前景，为大气压冷等离子体的牙科临床应用奠定了基础。