陈清艳

（上海旺旺食品集团有限公司，上海 201103）

0 引言

双歧杆菌是人体和部分动物肠道内重要的组成部分，具有调整肠道功能及改善营养的作用、抗过敏、抗肿瘤和控制葡萄糖代谢等益生功能[1-9]。目前食品中可添加的双歧杆菌种类、菌株及产品形式呈多样化，双歧杆菌对营养需求及培养条件较为苛刻，其生长特性存在差异[10-12]，因此针对不同产品中双歧杆菌计数时，国标方法计数结果跟理论值存在较大差异。双歧杆菌活菌数量是评价产品功能性的关键指标，生产者有必要深入研究其培养条件，尽可能准确地证实其产品中双歧杆菌活菌的实际水平。本实验以乳双歧杆菌BB12和长双歧杆菌BB536益生菌锭片为样品，比较了MRS、半胱氨酸盐酸盐+MRS、双歧杆菌计数琼脂BBL 3种培养基培养计数结果，以选择最适合的培养基对益生菌产品中双歧杆菌进行计数实验。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MRS(ManRogosaS harpe)培养基、双歧杆菌计数琼脂BBL培养基、半胱氨酸盐酸盐、磷酸盐缓冲液、西红柿浸出液，北京陆桥；乳双歧杆菌BB12锭片、长双歧杆菌BB536锭片，本实验室自制。

1.2 仪器与设备

电磁加热搅拌器SLR，德国SCHOTT；高温高压灭菌釜MLS-3751L-PC，日本松下；拍击式均质器bagmixer 400vw、BagPipet移液器，法国Interscience；旋涡振荡器，德国IKA；双人垂直超净工作台CDA-1650-1，上海上净；AW 200SG厌氧工作站，英国ELECTROTEK；50i生物显微镜，NIKON。

1.3 实验方法

1.3.1 样品稀释

无菌操作称取样品25 g，加入225 mL的无菌磷酸盐缓冲液中，拍击式均质2 min，充分振摇混合均匀，制成10-1稀释度的样液；吸取10-1稀释度样液1 mL，加入9 mL无菌磷酸盐缓冲液中，旋涡振荡制成10-2稀释度；依次操作，制成目标稀释度。

1.3.2 接种

根据样品益生菌添加量预估其可能双歧杆菌含量，选择3个合适稀释度的样液接种，每种培养基每个稀释度分别接种2个平皿，每皿加样1 mL，故每个稀释度样液分别接6个平皿，其中2个平皿倾注MRS培养基；2个平皿倾注半胱氨酸盐酸盐+MRS培养基，2个平皿倾注BBL培养基。

1.3.3 培养

待琼脂凝固后，将平板倒置于厌氧工作站，36±1℃培养72±2 h。

1.3.4 菌落观察计数

选取菌落数在30~300 CFU内的平板计数。

1.3.5 涂片镜检

观察细胞形态和纯度（是否有杂菌），双歧杆菌为革兰氏阳性，无芽胞，杆状；乳双歧杆菌BB12呈短杆状，有时候一端呈匙状，单个或成对；长双歧杆菌BB536呈细长杆状，有时候一端或两端分叉。

1.3.6 菌落数计算

依GB 4789.35 6.4计算每g样品中双歧杆菌菌落数[13]。

2 结果与讨论

2.1 计数结果比较分析

添加乳双歧杆菌BB12的益生菌锭片样品，MRS、半胱氨酸盐酸盐+MRS（以下简写为CYSMRS）、BBL 3种培养基计数结果如下表1，BBL计数结果较MRS、CYS-MRS高，CYS-MRS培养基计数结果普遍高于MRS；BBL平板的上的菌落较小，需要借助菌落计数器观察计数，MRS、CYSMRS平板上的菌落较大，肉眼即可观察计数，如图1所示。

图1 乳双歧杆菌BB12培养情况

表1 3种培养基对BB12锭片样品中双歧杆菌计数结果

对表1计数结果进行分析，MRS与CYS-MRS培养计数结果无显著差异（P＞0.05），MRS与BBL、CYS-MRS与BBL培养计数结果差异显著（P＜0.05）。

对添加长双歧杆菌BB536的益生菌锭片样品，MRS、CYS-MRS、BBL 3种培养基计数结果如表2。3种培养基计数结果差异不明显，菌落生长情况同BB12，BBL平板上菌落较小，MRS、CYS-MRS平板上菌落较大。

表2 3种培养基对BB536锭片样品中双歧杆菌计数结果

（续表2）

对表2计数结果进行数据分析，MRS、CYSMRS和BBL 3种培养基培养计数结果无显著差异（P＞0.05）。

2.2 细胞形态观察结果

革兰氏染色后，在物镜100×油镜，15×目镜条件下镜检。乳双歧杆菌BB12细胞呈革兰氏阳性，棒状，有时候一端呈匙状，单个或成对排列如图2。长双歧杆菌BB536的细胞呈细长杆状，一端有时呈匙状，有时一端或两端呈分叉状，单个排列，如图3。形态随培养时间和培养基可能有变化。

图2 乳双歧杆菌BB12的细胞形态

图3 长双歧杆菌BB536的细胞形态

3 结论

根据56个添加双歧杆菌的益生菌锭片样品中双歧杆菌测定结果看，添加乳双歧杆菌杆菌BB12的锭片样品，MRS、半胱胺酸盐酸盐+MRS、BBL 3种培养基计数结果差异较显著，BBL计数结果最高，其次是半胱氨酸盐酸盐+MRS，MRS培养基计数结果最低；对于添加长双歧杆菌BB536的益生菌锭片样品，上述3种培养基计数结果差异不显著。BB536锭片样品种双歧杆菌计数结果与预估添加菌量相近；BB12垫片样品中双歧杆菌计数结果较预估添加菌量低了约3个log/g，可能锭片加工工艺对该菌株活性损伤较大所致。

为了准确对双歧杆菌检验计数，很多实验室针对不同产品基质、不同稀释液、培养方式、鉴定方法等已经进行大量研究。现行标准方法有：（1）GB 4789.35[13]适用范围为食品样品，双歧杆菌计数培养基为添加莫匹罗星锂盐和半胱氨酸盐酸盐的改良MRS，莫匹罗星锂盐能够抑制乳杆菌的生长而不抑制双歧杆菌的生长，L-半胱氨酸能够提供双歧杆菌生长的还原性环境，促进双歧杆菌生长[14]；（2）GB 4789.34[15]适用范围是产品中仅含有双歧杆菌属的样品，培养基为双歧杆菌计数琼脂BBL或MRS琼脂培养基；（3）QB/T 4575[16]食品加工用乳酸菌中A.4对于单纯的双歧杆菌的检测，采用MRS或TOS培养基。在200 mL培养基中加入2 mL浓度为5%的盐酸半胱氨酸溶液（每次使用前配制）。

根据以上标准方法，对仅含有双歧杆菌属的样品进行双歧杆菌培养计数时，可以选择半胱氨酸盐酸盐+MRS、双歧杆菌计数培养基BBL、MRS培养基或TOS培养基。

另外，样品溶解用稀释液的选择，对双歧杆菌的计数结果可能也有影响。王似锦等[14]比较了生理盐水（NS）、林格液（QSR液）、磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）、半胱氨酸磷酸盐缓冲液(CYS缓冲液)4种稀释液进行双歧杆菌计数的结果差异，发现CYS缓冲液作为稀释液时计数结果最高，讨论可能因CYS缓冲液中的L-半胱氨酸盐酸盐具有还原性，可以为双歧杆菌生长提供一定的厌氧环境，并且CYS缓冲液含有吐温80能使双歧杆菌更充分的释放和分散均匀。因此，有必要进行稀释液比对实验，根据产品特性及产品中添加的双歧杆菌的菌种及菌株不同，以针对性地选择最佳稀释液，从而有利于提高双歧杆菌的检出率，准确计数。后续将进一步进行稀释液比对实验，及稀释液与培养基组合比对实验，以确认该两种双歧杆菌产品的最优稀释液和培养基。

依实验数据看，相同工艺生产的双歧杆菌益生菌产品，若所含的双歧杆菌的菌种不同，不同培养基进行培养计数，结果可能存在差异。要对产品中双歧杆菌准确计数定量，则有必要对双歧杆菌计数的多种培养基进行比对实验，选择最优培养基用于双歧杆菌的培养计数，使结果更精准，为益生菌产品开发阶段评价原料及产品中双歧杆菌的含量及益生菌产品在储存期间双歧杆菌的稳定性、工艺及配方的改进提供可靠的参考数据。