3种食品中双歧杆菌鉴定方法的比较分析

2022-11-13丁清龙苏妙贞周露

质量安全与检验检测 2022年2期

丁清龙苏妙贞周露

（广东省食品检验所广东广州 510435）

1 前言

双歧杆菌是细菌分类学层面上属的名称，是一类厌氧的、革兰氏阳性菌，被认为是人体健康的重要标志之一，可以在人体肠道内定殖，阻止人体内有害致病微生物的繁殖，调节人体肠道菌群的微生态平衡[1]，还具有防癌、降低胆固醇、抗衰老等多种对机体健康有益的作用[2-3]。根据2002年FAO/WHO对益生菌的定义，双歧杆菌属于益生菌的范畴。相关研究表明，摄入一定量的双歧杆菌对维持和改善机体健康具有重要作用[4]。因此，双歧杆菌常作为一种营养因子被添加至酸奶、保健食品、婴幼儿配方食品、特殊医学用途食品中。

在食品中加入的双歧杆菌主要有6种：长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）、短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）、两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）、青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）和婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp.infantis）。不同种类的双歧杆菌，具有不同的生理作用。以婴幼儿食品为例，我国卫生部发布的《关于公布可用于婴幼儿食品的菌种名单的公告》中，规定了允许添加的双歧杆菌的菌种类别[5]。对于标识含双歧杆菌的食品，其添加的双歧杆菌种类不仅要符合食品经济价值和营养价值的要求，也必须符合监管部门的规定。因此，食品中双歧杆菌种类的鉴定具有重要意义。

目前，用于细菌鉴定的方法均可用于鉴定双歧杆菌，主要包括生化鉴定法、质谱鉴定法和分子生物学法。生化鉴定法较为传统，现行国家标准GB4789.34-2016中的双歧杆菌检验即采用该方法[6-7]。质谱鉴定法主要是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法（MALDI-TOF MS），利用该技术，能够使菌体蛋白电离构建的“指纹图谱”实现多种益生菌的鉴定[8]。分子生物学方法包括DNA印记技术、脉冲场电泳技术、基于PCR扩增的16SrDNA和16S-23SrDNA间序列分析和全基因组测序[9-10]。

本文应用生化鉴定法、MALDI-TOF质谱法和全基因测序法这3种方法对目前食品中可能添加的多种双歧杆菌进行鉴定，并对这3种方法的鉴定结果进行综合比较与分析，以期为双歧杆菌标准检验方法的改进和添加双歧杆菌食品的日常监管提供技术参考。

2 材料与方法

2.1 主要仪器与试剂

生化培养箱（LRH-250，上海一恒科学仪器有限公司）；生物安全柜（AC2-4S1，新加坡Esco）；全自动细菌鉴定仪（VITEK 2 Compact，法国生物梅里埃股份有限公司）；MALDI-TOF质谱仪（VITEK MS，法国梅里埃股份有限公司）；离心机（5430，德国Eppendorf）。

全基因组测序委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行，二代测序仪为Illumina公司生产的novaseq。

MRS培养基（北京路桥技术股份有限公司）；厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡片（生物梅里埃美国股份有限公司）；质谱样品处理基质溶液（生物梅里埃法国股份有限公司）；全自动微生物质谱检测系统-VITEK MS-DS靶板（生物梅里埃法国股份有限公司）；细菌基因组提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司）。

实验中所使用的双歧杆菌盲样，均由中国食品药品检定研究院提供，样品信息见表1。

表1 双歧杆菌盲样

2.2 实验方法

2.2.1 菌种分离

将含有盲样的西林瓶在室温条件下平衡5 min；向其中加入1 mL无菌生理盐水，使盲样溶解并混合均匀；使用无菌生理盐水将溶解的样品稀释1 000倍；吸取100 μL稀释后的样品液于MRS平板涂布，厌氧条件下36℃培养48 h；待生菌后，挑取单菌落划线于MRS平板；厌氧条件下36℃培养48 h，得到双歧杆菌可疑菌。

2.2.2 VITEK生化鉴定

用无菌接种环挑取部分双歧杆菌可疑菌菌苔，置于0.45%无菌生理盐水中，制备菌悬液；使菌悬液的麦氏浊度控制在2.7～3.3之间；取出厌氧菌及棒状杆菌鉴定卡片插入菌悬液中，在VITEK 2 Compact上进行检测。

2.2.3 MALDI-TOF质谱鉴定

用接种环挑取1环待测样品，置于装有300 μL超纯水的Eppendorf管中，涡旋混合1 min；向其中加入900 μL无水乙醇，涡旋混合1 min；将Eppendorf管13000r/min离心2min，去除上清液，重复离心1次；用移液器去除残留的乙醇溶液；向其中加入50 μL 70%的甲酸水溶液，用移液器反复吹打混合均匀，室温放置5 min；再向其中加入等体积的乙腈，用移液器反复吹打混合均匀；将其13 000r/min离心2 min，取2 μL上清液，置于质谱靶板上；室温自然晾干后，再覆盖1 μL的基质液；再晾干后，置于VITEK MS上进行检测。实验过程中，使用大肠杆菌ATCC8739作为质控。

2.2.4 全基因组测序

用接种环挑取一定量待测菌菌苔置于无菌生理盐水中，12 000 r/min离心1min；去除上清液，收集待测菌菌体；使用商业化细菌DNA提取试剂盒进行DNA提取，提取步骤见其说明书；将提取的DNA低温寄送至生工生物工程（上海）股份有限公司，进行全基因组测序。

全基因组测序数据经过质控后，使用SPAdes软件进行拼接；使用GAPFiller对拼接结果补GAP，得到最终的contig文件；将contig文件上传至Center for Genomic Epidemiology网站（网址：http://www.genomicepidemiology.org）的KmerFinder 3.1中进行比对，得到鉴定结果。

3 结果与分析

3.1 生化鉴定法结果

依据不同生化反应的差异进行微生物鉴定，是一种传统方法。采用梅里埃VITEK 2 Compact生化鉴定系统，对9个盲样分离纯化的双歧杆菌可疑菌进行鉴定，鉴定结果见表2。9个样品VITEK生化鉴定的结果均为双歧杆菌属（Bifidobacterium spp），平均置信度为93.6%（89%～97%）。同时，4、9和12号样品的双歧杆菌可疑菌株经过3次菌种纯化鉴定，才得到“双歧杆菌属”的结果，其余样品均为仅通过1次鉴定即得出双歧杆菌的结果。结果表明，采用VITEK生化鉴定法可以鉴定到双歧杆菌属，但是无法鉴定至种水平。

表2 VITEK生化鉴定结果

3.2 MALDI-TOF质谱鉴定结果

利用MALDI-TOF质谱轰击菌体蛋白产生的“指纹图谱”进行微生物鉴定，具有方便、快速的优点。采用梅里埃VITEK-MS（MALDI-TOF质谱），对9个盲样分离纯化的双歧杆菌可疑菌进行鉴定，鉴定结果见表3。9个样品的质谱鉴定结果评分均为99.9分（满分100分），说明其鉴定的准确性非常高；12、15和18号样品的质谱鉴定结果为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis），与制备这3个盲样所用的双歧杆菌菌种一致；其余6个样品的鉴定结果为双歧杆菌属。结果表明，采用MALDI-TOF质谱鉴定法对动物双歧杆菌进行鉴定，可以准确鉴定至种水平，但对其它5种双歧杆菌只能鉴定至属水平。若想采用MALDI-TOF质谱法实现对这5种双歧杆菌种水平的鉴定，可能还需要依赖其自建库的功能，构建这5种菌的特异性MALDI-TOF质谱“指纹图谱”。

表3 MALDI-TOF MS鉴定结果

3.3 全基因组测序鉴定结果

随着技术的不断进步，利用高通量测序仪对微生物的全部基因组进行测序的方法已经非常成熟。使用二代测序仪对9个盲样分离纯化的双歧杆菌可疑菌进行测序，将测序结果进行比对后，得到9株菌的鉴定结果，见表4。4号样品的鉴定结果为两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）；9号样品的鉴定结果为婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium longum subsp.Infantis strain）；12、15和18号样品的鉴定结果为动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）；27、30和35号样品的鉴定结果为短双歧杆菌（Bifidobacterium breve）；42号样品的鉴定结果为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）。鉴定结果与制备盲样时所用的双歧杆菌菌种一致。结果表明，采用全基因测序的方法可以使双歧杆菌鉴定至属水平。

表4 全基因组测序鉴定结果

3.4 3种鉴定方法的比较分析

从3种方法的鉴定结果来看，VITEK生化鉴定法无法实现对双歧杆菌种水平的鉴定，MALDI-TOF质谱法对个别菌株可以鉴定至种水平，全基因组测序法可以很好地实现种水平的鉴定；在实验的稳定性（重现性）方面，VITEK鉴定法一次实验的成功率低于MALDI-TOF质谱法和全基因组测序法；在检测时间方面（从对样品进行前处理至获得鉴定结果），MALDI-TOF质谱法所需的时间少于VITEK鉴定法和全基因组测序法；在实验成本方面，VITEK鉴定法和MALDI-TOF质谱法基本持平，而全基因组测序的成本高于前2种方法，见表5。