朱云蕾， 黄清梅， 黄桂连， 陈玉君

人类肠道存在复杂、多样和动态的微生物群落。肠道微生物群在抵抗肠道病原体定植、培养和促进宿主免疫系统成熟以及宿主代谢方面发挥不可或缺的作用[1]。婴儿肠道微生物群从出生起开始建立，容易受到多种围产期因素的影响，包括分娩方式、喂养类型、胎龄和抗生素用药等[2-3]。研究显示，约25%的女性在怀孕期间接受过一个疗程的抗生素治疗，抗生素约占妊娠期所用处方药物的80%[4]。目前，越来越多的研究认为母亲产前使用抗生素是影响新生儿肠道菌群建立的因素之一[5]。本研究应用高通量测序技术探讨产前抗生素暴露对晚期早产儿肠道菌群的影响，现报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象 选择2020年3月至2021年5月在广西医科大学第二附属医院住院治疗的晚期早产儿13例，胎龄340/7～366/7周。其中5例早产儿母亲产前使用过抗生素(观察组)，平均疗程为(2.20±1.10)d，余8例早产儿母亲产前未使用过抗生素(对照组)。早产儿出生后均为混合喂养，两组在分娩方式、胎龄、性别、出生体重等方面比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。研究获早产儿父母或法定监护人知情同意。

表1 两组一般情况比较

1.2纳入与排除标准 观察组纳入标准：(1)34周≤胎龄<37周；(2)出生后即转入新生儿科住院治疗；(3)母亲产前2周内使用过β-内酰胺类抗生素(五水头孢唑林钠)。对照组纳入标准：(1)出生后即转入新生儿科住院治疗；(2)母亲产前2周内未使用抗生素；(3)性别、胎龄、分娩方式、出生体重与观察组相匹配。排除标准：(1)合并严重复杂的先天性心脏病、唐氏综合征、遗传代谢病或重度窒息；(2)合并坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)、败血症、腹裂、胃肠道穿孔、消化道畸形需手术治疗者；(3)粪便标本收集期间早产儿接受抗生素及益生菌治疗。

1.3标本采集 采用无菌通便的方法，使用无菌粪便采集杯收集日龄为3(D3)、7(D7)、14(D14)天的婴儿粪便标本，-80 ℃冰箱中冻存备检。

1.4细菌DNA提取与测序 采用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit试剂盒(Omega Bio-Tek，美国)提取粪便细菌基因组DNA，检测DNA纯度、浓度及完整性。通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)法扩增16SrRNA的V3-V4区。应用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.5生物信息分析 对Illumina Miseq PE300平台获得的原始序列进行质控和拼接。应用UPARSE软件(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)，根据97%的相似度对序列进行操作分类单元(operational taxonomic units,OUT)聚类。基于RDP classifier贝叶斯算法进行分类学分析，根据结果，分析各组肠道菌群的多样性指数及物种组成。

1.6观察指标 (1)采用Shannon指数进行多样性分析，其值越大，说明菌群多样性越高。(2)通过分析肠道菌群在门、属水平的相对丰度来描述其物种组成。

数(n)表示，组间比较采用Fisher确切概率法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1测序结果 共收取39份粪便样本，其中观察组有1例D3日龄的粪便样本PCR扩增失败。38份测序样本经处理后共得到1 081 366条优化序列，所检测到的肠道菌群隶属于1域、1界、11门、20纲、35目、64科、132属、217种、324 OUT。

2.2两组D3、D7、D14日龄婴儿Shannon指数比较

在D3、D7、D14，两组Shannon指数随婴儿日龄的增长而上升，观察组Shannon指数始终低于对照组，但仅在D3时观察组Shannon指数与对照组比较差异有统计学意义(Z=-2.717，P=0.007)。见图1。

2.3两组肠道菌群门水平比较 随着婴儿日龄的增长，对照组变形菌门占比降低而观察组占比升高；对照组厚壁菌门占比升高而观察组占比降低。在D3、D7、D14日龄，对照组拟杆菌门占比呈先降低后升高的趋势，而观察组呈逐渐升高的趋势。两组放线菌门占比均随婴儿日龄的增长而升高。见图2。

图1 两组D3、D7、D14日龄婴儿Shannon指数比较图

图2 两组肠道菌群门水平比较图

2.4两组肠道菌群属水平比较 随着婴儿日龄的增长，对照组肠球菌属占比逐渐增加，观察组肠球菌属水平呈先增高再降低趋势。对照组克雷伯杆菌属占比先增加后降低，而观察组克雷伯杆菌属占比逐渐增加。观察组副拟杆菌属水平呈先增高再降低趋势，而对照组几乎检测不到副拟杆菌属。在D3时，与对照组比较，观察组双歧杆菌属定植减少，厌氧芽胞杆菌属、肠杆菌属及克吕沃尔氏菌属定植延迟。见图3。

图3 两组肠道菌群属水平比较图

3 讨论

3.1抗生素对现代医学具有重要意义，其在维护人类健康方面发挥了重要作用。然而，人们也越来越担心使用抗生素所带来的负面效果，包括对肠道菌群造成的损害。本研究结果显示，与对照组比较，观察组肠道菌群的多样性和丰富度均显著降低，在D3日龄时，对照组Shannon指数显著高于观察组，表明产前抗生素暴露可降低早产儿肠道菌群的多样性，这与国外多项研究结果[6-8]相似。在本研究期间，观察组Shannon指数始终低于对照组，但仅在D3差异有统计学意义，这可能与产前抗生素暴露对早产儿肠道菌群的影响减弱有关，早产儿肠道菌群在其他影响因素及自身调节下，菌群多样性逐渐恢复。在门水平上，对照组变形菌门占比逐渐降低，厚壁菌门占比逐渐升高，而观察组则成相反趋势变化。在属水平上，D3日龄时，观察组菌属多样性单一，以肠球菌属、埃希菌-志贺菌属、葡萄球菌属为主，部分肠道共生菌如双歧杆菌属、梭状芽胞杆菌属、柠檬酸杆菌属等定植延迟，表明产前使用抗生素可影响早产儿肠道菌群的正常定植，抑制肠道细菌的生长，使早产儿肠道部分有益菌如双歧杆菌定植延迟，这与Zou等[9]的研究结果相似。Stearns等[7]研究发现，产前抗生素暴露使双歧杆菌定植延迟且相对丰度降低，这种影响可持续至产后6周，较本研究的恢复时间慢，这可能因该研究对象抗生素暴露时间及抗生素使用种类与本研究不同有关。

3.2多项研究表明，产前抗生素暴露的足月儿肠道变形菌门相对丰度增加，放线菌门和拟杆菌门相对丰度减少,但厚壁菌门相对丰度变化存在争议[7，10-11]。本研究观察到抗生素暴露的早产儿变形菌门相对丰度日益上升，厚壁菌门相对丰度日益降低。变形菌门中有害菌属多于有益菌属，肠道中变形菌门的增多反映了肠道微生物群落结构的不稳定或生态失调[12]，由此推测，产前抗生素暴露可能与早产儿肠道菌群失调有关。另外，变形菌门丰度上升和厚壁菌门丰度降低也可能增加NEC的发生率[13]。副拟杆菌属是一类革兰阴性厌氧菌，是人体核心菌群之一，其对多种β-内酰胺类抗生素具有广泛的耐药性[14-15]。也有研究显示产前抗生素暴露与新生儿抗生素耐药增加有关[11]。本研究结果显示，与对照组比较，产前抗生素暴露使早产儿副拟杆菌属丰度增加，提示临床医师需要关注孕期抗生素的使用与新生儿产生抗生素耐药之间的关系。

3.3抗生素暴露可能对新生儿产生不良影响，如引起支气管肺发育不良[16]、肥胖[17]、哮喘[18]、湿疹[19]和早发性败血症[20]等，提示临床上需要权衡孕妇产前抗生素治疗的利弊。此外，本课题组前期研究发现，给予早产儿补充益生菌能增加其肠道微生物的多样性，促进肠道有益菌的定植[21]，提示有可能通过补充益生菌制剂来改善产前抗生素暴露婴儿肠道正常菌群的建立。但本研究也存在一些不足：(1)病例样本偏少，观察时间较短，未能观察产前抗生素暴露对晚期早产儿肠道菌群的远期影响；(2)所有样本均来源于母亲产前预防性使用抗生素，抗生素使用时间较短，未能了解到更长时间抗生素暴露对晚期早产儿肠道菌群的影响。这些问题有待进一步研究。

综上所述，产前抗生素暴露可影响早产儿肠道菌群的建立，改变其多样性和丰富度，使早产儿肠道菌群多样性降低，肠道共生菌定植延迟，提示临床医师需谨慎考虑对孕妇予以抗生素治疗，以防对新生儿产生不良影响。