何 荣，黄家强，张倩玉

(南京财经大学 食品科学与工程学院，南京 210023)

在各种凝胶中，蛋白质凝胶具有优异的功能性质、两亲性、生物相容性及生物降解性等[1]，在组织工程、组织修复及药物传递等方面具有广阔的应用前景[2-3]。天然蛋白质较易从天然物质中分离纯化获得，并广泛用于凝胶的制备。

植物蛋白具有很高的营养价值，为扩大其应用范围，常采用化学、物理以及生物等改性方法改善其功能性质[4-6]，使其达到特定产品所需的品质特性。其中，化学改性是植物蛋白改性常用的手段，主要包括酸碱化、脱酰胺、酰化和糖基化。其中糖基化反应可以改善蛋白质的乳化性、凝胶性、溶解性和热稳定性，具有良好的应用前景。转谷氨酰胺酶(TG酶)作为一种生物酶交联剂，可催化蛋白质、多肽发生分子内和分子间共价交联，进一步改善蛋白质的结构和功能[7]，如保水性和凝胶性等，进而改善食品的风味、口感、质地和外观等。目前对于多联合改性技术协同TG酶交联处理对植物蛋白凝胶理化性质、凝胶特性影响的报道较少。本研究以菜籽分离蛋白为原料，在酰化改性的基础上协同TG酶催化作用对菜籽蛋白进行了糖基化修饰制备菜籽蛋白凝胶，测定糖基化修饰前后菜籽蛋白凝胶的结构和功能性质，探究多联合改性技术对菜籽蛋白凝胶结构和功能性质的影响，以期为菜籽蛋白的多联合改性处理提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

菜籽粕，羧甲基壳聚糖(CMCS)、葡聚糖、羧甲基纤维素(CMC)、乙二醇、无水乙醇、溴化钾、氯化钠、氯化钾、琥珀酸酐、高碘酸钠、2-硝基苯甲酸(DTNB)、8-苯胺基-1-萘磺酸(ANS)、Tris-甘氨酸(Tris-Gly)、乙二胺四乙酸(EDTA)、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯。

TA.XTII plus质构仪，英国Stable Micro System公司；pH 计，瑞士梅特勒-托利多公司；IKA 磁力搅拌器，德国IKA仪器设备有限公司；HH-6B数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；MCR302型旋转流变仪，奥地利安东帕公司；TM3000扫描电子显微镜，日本日立公司；Tensor 27傅里叶红外光谱仪，德国布鲁克公司。

1.2 实验方法

1.2.1 菜籽分离蛋白的制备

根据戴彩霞等[8]的方法制备菜籽分离蛋白。将适量的菜籽粕按料液比1∶10分散于去离子水中，用1 mol/L的NaOH调pH至11，在50℃条件下搅拌3 h后，4℃、10 000g下离心30 min，收集上清液。用1 mol/L的HCl将上清液的pH调至4.5，在4℃下静置沉淀2 h，10 000g下离心30 min，收集沉淀。用无水乙醇洗涤沉淀，去除多酚成分，冷冻干燥，得到菜籽分离蛋白(RPI)。

1.2.2 酰化菜籽蛋白的制备

参考Wang等[9]的方法制备酰化菜籽蛋白。将菜籽分离蛋白溶解于去离子水中，制备菜籽分离蛋白质量分数为2%的溶液，并用2 mol/L的NaOH将溶液pH调至10.5。然后缓慢分次加入5%的琥珀酸酐(以菜籽分离蛋白质量计)，搅拌反应。在反应过程中，用2 mol/L的NaOH保持溶液的pH为10.5，当末次加入琥珀酸酐，调溶液pH至10.5后，将混合溶液用截留分子质量为7 kDa的透析袋透析48 h，冷冻干燥，得到酰化度为5%的酰化菜籽蛋白(ARPI)。

1.2.3 氧化葡聚糖的制备

采用Liu等[10]的方法，用高碘酸钠引入醛基氧化葡聚糖，制备氧化葡聚糖。将4 g葡聚糖和3.3 g高碘酸钠溶解于适量的去离子水中，在室温下黑暗中搅拌反应24 h。然后加入适量的乙二醇结束反应，用截留分子质量为500 Da的透析袋透析处理48 h，以除去未反应的高碘酸钠和用于终止反应的乙二醇，冷冻干燥，得氧化萄聚糖(DAD)。

1.2.4 菜籽蛋白凝胶的制备

在前期菜籽蛋白凝胶制备条件优化的基础上，采用以下工艺分别制备糖基化-酰化菜籽蛋白凝胶、菜籽分离蛋白凝胶和酰化菜籽蛋白凝胶。

糖基化-酰化菜籽蛋白凝胶的制备：按羧甲基壳聚糖 (CMCS)添加量10%、氧化葡聚糖(DAD)添加量12%和羧甲基纤维素(CMC)添加量15%(多糖添加量以酰化菜籽蛋白质量计)，分别与适量的酰化菜籽蛋白溶解在5 mg/mL NaCl溶液中，得到酰化菜籽蛋白质量分数为15%的悬浮液，再加入100 U/g(以酰化菜籽蛋白质量计)的TG酶。混合均匀后，加入1 mol/L的NaOH将混合溶液的pH调节至9，反应8 h。然后移取3 mL悬浮液到直径为28 mm、高度为57 mm的圆柱形玻璃小瓶中。将小瓶放置于90℃水浴中加热30 min，然后立即在冰浴中冷却至室温，在4℃条件下保存过夜，得到糖基化-酰化菜籽蛋白凝胶。

菜籽分离蛋白(RPI)凝胶和酰化菜籽蛋白(ARPI)凝胶的制备：分别以菜籽分离蛋白和酰化菜籽蛋白为原料，不添加多糖和TG酶，其他条件同糖基化-酰化菜籽蛋白凝胶的制备。

1.2.5 凝胶性能测定

使用配备有P/0.5不锈钢探针(直径为12.7 mm，圆柱形探针)的质构仪分析菜籽蛋白凝胶的凝胶特性(硬度和弹性)。参数设置如下:测试前速度0.5 mm/s；测试速度0.2 mm/s；测试后速度0.5 mm/s；触发力5 g，应变30%(TPA测试)。

1.2.6 接枝度测定

根据Guan等[11]的邻苯二甲醛(OPA)法并稍加改进，通过测定糖基化反应后菜籽蛋白游离氨基数量的变化，从而测定3种多糖与酰化菜籽蛋白的接枝度(DG)。取200 μL糖基化反应后悬浮液(PSA法测定蛋白质质量浓度为2.5 mg/mL)与4 mL现配的OPA混合，置于35℃水浴中反应3 min。然后测量溶液在340 nm处的吸光度。按下式计算接枝度(DG)。

(1)

式中：A0和A1分别为糖基化前后溶液的吸光度。

1.2.7 溶胀性能测试

将冻干后的凝胶样品制备成质量相等的近似形状，在37℃下浸泡于去离子水中，间隔预定时间(t)后取出称重，直至凝胶样品达到溶胀平衡(质量恒定)。根据下式计算凝胶的溶胀率(S)。

(2)

式中：m0、mt分别为冻干后的凝胶和t时刻凝胶的质量，g。

1.2.8 截面形貌观察

将冻干的凝胶样品喷金后，在加速电压为15 kV的条件下，用扫描电子显微镜对横截面进行观察拍照，选取500倍的图片进行分析。

1.2.9 流变性能测试

采用旋转流变仪配合20 mm平行板装置进行流变实验。分别制备质量浓度为150 mg/mL的凝胶样品溶液。流变仪设置条件为：平行板间隙1 mm，应变1%；频率扫描范围0.01～100 Hz；温度从20℃升高到90℃，升温速率5℃/min；角频率1 Hz。记录储能模量(G′)和耗能模量(G″)的变化。

1.2.10 表面疏水性测定

改性前后菜籽蛋白凝胶的表面疏水性采用ANS探针法测定[12]。将一定量的凝胶样品溶解在0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 8.0)中，并稀释至50～250 μg/mL。每种质量浓度样品各取4 mL，分别加入20 μL 8 mmol/L的ANS溶液(溶解于0.01 mol/L磷酸盐缓冲液中)。通过酶标仪在激发波长390 nm、发射波长470 nm下测定样品的荧光强度。用荧光强度-样品质量浓度曲线的初始斜率(线性回归分析计算)作为表面疏水性指标。

1.2.11 自由巯基含量测定

根据Boostani等[13]的方法测定自由巯基含量。将4 mg 2-硝基苯甲酸溶解在1 mL Tris-甘氨酸缓冲液(0.086 mol/L Tris，0.09 mol/L甘氨酸，0.004 mol/L EDTA，pH 8.0)中用以制备Ellman’s试剂。在含有8 mol/L尿素的Tris-甘氨酸缓冲液中加入菜籽蛋白凝胶溶液，使其最终质量浓度为1 mg/mL。然后与50 μL的Ellman’s试剂混匀，在室温下反应30 min，然后在8 000g下离心20 min，取上清液，测定412 nm处的吸光度，按下式计算蛋白凝胶溶液中自由巯基含量，然后再换算为蛋白凝胶样品中自由巯基含量(W)(以蛋白质质量计)。

(3)

式中：73.53=106/(1.36×104)，1.36×104为摩尔消光系数；D为样品稀释倍数；C为样品质量浓度。

1.2.12 傅里叶红外光谱测定

按照Brindha等[7]的方法并稍加修改。将冻干凝胶样品进行研磨，过0.12 mm(120目)筛，将样品粉末与溴化钾粉末充分混合后压成片剂，在400～4 000 cm-1范围内测定红外光谱。

红外数据通过OPUS7.2转化为吸收谱图，截取1 600～1 700 cm-1波段的红外光谱，进行傅里叶退卷积处理，再用PeakFitv 4.12进行分峰拟合处理，最后用Origin 2019绘制分峰拟合图。根据拟合子峰的积分计算蛋白质4种二级结构的相对含量。

1.2.13 数据分析

每个实验至少重复3次，结果采用“平均值±标准差”表示。数据由IBM SPSS 26.0软件的单因素方差分析(ANOVA)进行分析，显著性p<0.05。

2 结果与分析

2.1 菜籽蛋白凝胶性能分析

按1.2.4分别制备CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶、CMC-ARPI凝胶、RPI凝胶和ARPI凝胶，测定5种菜籽蛋白凝胶的凝胶性能，结果如图1所示。由图1可知，CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶的硬度分别为92.337、56.814、49.700 g, 弹性分别为0.960、0.967、1.043。ARPI凝胶、CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶的硬度和弹性都显著高于RPI凝胶，且CMCS-ARPI凝胶的硬度最高。有研究显示，酰化和糖基化分别作用均可以提高菜籽蛋白凝胶的硬度和弹性[14]。糖基化修饰协同酰化作用后菜籽蛋白凝胶的硬度和弹性均得到改善。

注：A.RPI凝胶；B.ARPI凝胶；C.CMCS-ARPI凝胶；D.DAD-ARPI凝胶；E.CMC-ARPI凝胶。菜籽蛋白凝胶同一指标不同小写字母表示差异显著，p<0.05。下同

2.2 菜籽蛋白凝胶的接枝度

羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖、羧甲基纤维素分别与酰化菜籽蛋白进行糖基化反应，接枝度随反应时间的变化如图2所示。

图2 菜籽蛋白凝胶接枝度随反应时间的变化

由图2可知，随反应时间的延长，酰化菜籽蛋白与羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖、羧甲基纤维素的接枝度显著增加，分别在5、6、6 h接枝度达到最高。但随着反应时间进一步延长，接枝度降低。这可能是由于在酰化菜籽蛋白与多糖完全反应后，菜籽蛋白变性程度增加，蛋白质发生再聚集，导致接枝度降低。羧甲基壳聚糖与酰化菜籽蛋白的接枝度最高，其次是氧化葡聚糖和羧甲基纤维素。

2.3 菜籽蛋白凝胶的溶胀性能

菜籽蛋白和多糖都是大分子物质，具有高度亲水性，制备的凝胶也具有良好的吸水性能。菜籽蛋白凝胶的溶胀率见图3。

图3 菜籽蛋白凝胶的溶胀率

从图3可知， ARPI凝胶、CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶在去离子水中达到平衡时的溶胀率分别为7.769、8.432、8.667 g/g和7.360 g/g。其中CMCS-ARPI凝胶和DAD-ARPI 凝胶的溶胀性能都高于未经糖基化修饰的ARPI凝胶，这可能是因为羧甲基壳聚糖和氧化葡聚糖与酰化菜籽蛋白接枝度较高，形成的凝胶结构网络的交联密度较大，孔洞直径和数量较为适中，因此能截留并包裹住更多的水分子，表现出更好的溶胀性能。CMC-ARPI凝胶的弹性优于其他凝胶样品，但是接枝度较低，形成的凝胶结构网络孔洞直径较大，内部的网络结构也较为稀疏，容易使水分子流失，导致其溶胀性能相对较差。同时，糖基化修饰的酰化菜籽蛋白凝胶在5 h时达到溶胀平衡，而未经修饰的酰化菜籽蛋白凝胶在4 h就已达到溶胀平衡，这是因为交联密度的增加减慢了水分子扩散到凝胶内部的速率。Sharma等[15]在研究抗菌型壳聚糖基凝胶时测得其溶胀率为3.9 g/g，与之相比，糖基化协同酰化改性制备的菜籽蛋白凝胶溶胀性能更好，且具备适宜的吸湿速率。

2.4 菜籽蛋白凝胶的截面形貌

菜籽蛋白凝胶截面扫描电镜图如图4所示。

注：A.ARPI凝胶;B.CMCS-ARPI凝胶;C.DAD-ARPI凝胶;D.CMC-ARPI凝胶。

由图4可知，4种凝胶冻干后的截面均有许多孔洞、腔室的存在，ARPI凝胶呈现出数量最多、排列最为紧密的孔洞结构，且孔洞形状多为扁状椭圆形。糖基化修饰的酰化菜籽蛋白凝胶结构上的孔洞数量都少于ARPI凝胶，其中CMCS-ARPI凝胶与DAD-ARPI凝胶形成的网络结构整齐，且呈规则、密集的圆形，因而能截留更多的水分子，使溶胀性能提升。而CMC-ARPI凝胶的孔洞直径最大，网络结构稀疏，易使水分子流失，相应硬度不理想，溶胀性能较差，与前述结果一致。

2.5 菜籽蛋白凝胶的流变性能

菜籽蛋白凝胶的储能模量和耗能模量见图5。

图5 菜籽蛋白凝胶的储能模量(G′)和耗能模量(G″)

从图5可以看出，菜籽蛋白凝胶的储能模量(G′)随着频率增加而增加，与文献[16-17]报道一致。其中CMCS-ARPI凝胶的G′最高，即凝胶强度最高，这与CMCS与ARPI的接枝度最高有关。另外，菜籽蛋白凝胶的耗能模量(G″)也随着频率的增加而增加。

菜籽蛋白凝胶样品储能模量和耗能模量的温度依赖性如图6所示。

由图6可知，ARPI凝胶、CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶的G′均随着温度升高而增加，这可能是由于加热改变了凝胶网络的结构，逐渐加强了凝胶结构[18]。G′大于G″时的温度通常作为凝胶点[19]。ARPI凝胶、CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶的G′总是大于G″，这表明它们的tanδ值(tanδ=G″/G′)接近于0，在室温下就已接近凝胶状态[20]。而RPI凝胶的G′先小于G″，后大于G″，凝胶点超过50℃(图略)。这说明适度的酰化改善了菜籽蛋白的凝胶性能，而在糖基化修饰的协同作用下，凝胶性能又得到了显著的提升，尤其是CMCS-ARPI凝胶的凝胶强度最大，达到了较为理想的效果。

2.6 菜籽蛋白凝胶的结构

2.6.1 表面疏水性和自由巯基含量

菜籽蛋白凝胶的表面疏水性和自由巯基含量分别见图7、图8。

图7 菜籽蛋白凝胶的表面疏水性

由图7可以看出，经过酰化处理和糖基化-酰化修饰的菜籽蛋白凝胶表面疏水性显著提高，其中CMCS-ARPI凝胶的表面疏水性最高，为1 305.1。表明酰化处理和糖基化修饰都可以诱导蛋白质中疏水性氨基酸基团的暴露。然而，与不同的多糖进行糖基化反应后ARPI凝胶的疏水性变化不同，这可能是由于不同糖基化引起的电荷频率和电负性的变化不同[21]。也有研究显示，蛋白质经糖基化改性后由于糖链上的羟基可以增加蛋白质的亲水性，改变亲水性和疏水性的平衡，并且部分屏蔽表面疏水基团，从而使得表面疏水性降低[22]。CMCS-ARPI凝胶表面疏水性最高，这可能是因为羧甲基壳聚糖与酰化菜籽蛋白的接枝度最高，交联较为紧密，因此减少了较多蛋白质的正电荷，增加了亚基之间的排斥，展开了蛋白质结构，最终暴露了更多疏水基团，提高了表面疏水性，疏水相互作用的提高进一步增强了蛋白质凝胶的硬度和弹性。

图8 菜籽蛋白凝胶的自由巯基含量

此外，热诱导凝胶的形成与硫醇基团向二硫键的转化有关，这是维持凝胶结构的重要力量[23]。由图8可知，与RPI凝胶相比，糖基化协同酰化修饰的菜籽蛋白凝胶中自由巯基含量显著减少，其中CMCS-ARPI凝胶的自由疏基含量最低，为1.73 μmol/g，这归因于蛋白质疏水相互作用导致的蛋白质聚集和二硫键的形成[24]。酰化和糖基化修饰后，自由巯基含量降低，形成了更多的二硫键。与RPI凝胶和ARPI凝胶相比，CMCS-ARPI凝胶、DAD-ARPI凝胶和CMC-ARPI凝胶的自由巯基含量更少，硬度和弹性均有所提高，尤其是CMCS-ARPI凝胶的硬度和弹性分别达到92.337 g和0.960。因此，二硫键是影响菜籽蛋白凝胶硬度和弹性的重要因素。

2.6.2 二级结构分析

图9 菜籽蛋白凝胶蛋白质的二级结构含量

由图9可知，与RPI凝胶相比，ARPI凝胶中α-螺旋和β-转角的含量增加，β-折叠的含量没有变化，无规则卷曲含量降低，即ARPI凝胶中有序结构增加。这些结果表明，在琥珀酸基团缀合后，蛋白质的结构发生了显著变化，酰化作用诱导无规则卷曲向有序结构转变。在芸豆蛋白的二级结构中也有类似的发现[26]。这可能是由于酰化反应中大量的阴离子琥珀酰基团的共轭作用在RPI内产生空间位阻，引起了RPI内强烈的静电排斥作用。糖基化协同酰化改性后，与ARPI凝胶蛋白质二级结构相比，CMC-ARPI凝胶未发生明显变化，DAD-ARPI 凝胶的有序结构增加，表现为β-折叠含量的增加，且有一小部分α-螺旋转变为β-折叠，这与氧化葡聚糖的修饰改变了蛋白质和蛋白质之间相互作用和持水性，增加了凝胶的动态黏弹性有关[27]。CMCS-ARPI凝胶蛋白质的α-螺旋含量是凝胶样品中最高的。相比于其他二级结构而言，α-螺旋是一种相对规则且稳定性较高的构象，这可能也是CMCS-ARPI凝胶内部网络结构最为紧密有序，硬度和弹性较佳的一个重要原因。综上所述，酰化改性和糖基化协同酰化改性都改变了菜籽蛋白的分子结构，在一定程度上使修饰后的菜籽蛋白凝胶的凝胶性质得到了改善。

3 结 论

本研究在酰化改性的基础上，分别以羧甲基壳聚糖、氧化葡聚糖和羧甲基纤维素协同TG酶催化作用对菜籽蛋白进行糖基化修饰，并对糖基化修饰前后的凝胶产物进行了结构和功能性质测定。研究发现，羧甲基壳聚糖协同琥珀酸酐酰化修饰菜籽蛋白，获得的菜籽蛋白凝胶硬度最高，为92.337 g，弹性较好，为0.960；其表面疏水性最高，为1 305.1，自由巯基含量最低，为1.73 μmol/g。红外光谱结果显示，糖基化-酰化修饰后，菜籽蛋白凝胶的α-螺旋、β-转角、β-折叠和无规则卷曲含量都有不同程度的变化，糖基化修饰改变了酰化菜籽蛋白的分子结构，这与凝胶强度、弹性等功能性质的变化相关。糖基化修饰的酰化菜籽蛋白凝胶的结构和功能也发生了改变，相较于糖基化修饰前形成了更加致密且均匀的凝胶网络结构，使其凝胶强度、流变性能和溶胀性能均得到了改善。