李 津 宋 强△ 高铁祥

葛根芩连汤治疗糖尿病的作用已被中医药界所认同，该应用可谓古方新用、异病同治。从中医理论来讲，糖尿病属中医“消渴”范畴，多由长期嗜食肥甘厚味，辛辣香燥，使脾胃运化失职，致积热内蕴，化燥伤津，消谷耗液，而发为消渴。葛根芩连汤具有升阳运脾、清热燥湿、润燥生津的功效，符合消渴病脾失健运、胃肠湿热、燥热伤津的病机。现代药理研究也证实了葛根芩连汤治疗糖尿病的有效性。

中药发酵技术可谓现代生物技术和中药研究的交叉结合，它利用微生物强大的分解转化物质的能力来生产新型中药，在中医药研究开发和中药材资源的保护与利用等方面给我们提供了新的思路。课题组前期采用中药发酵技术对葛根芩连汤进行发酵处理，确定了最佳优化的发酵条件。

氧化应激可引起胰岛素分泌不足及胰岛素抵抗，反之胰岛素分泌不足及胰岛素抵抗也可影响氧化应激，说明2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus，T2DM)可能通过氧化应激诱导其发生。本实验通过观察葛根芩连汤发酵液对T2DM大鼠氧化应激指标的影响，旨在阐明葛根芩连汤发酵液防治T2DM的增效作用及作用机制。

1 材料

1.1 药物葛根芩连汤水煎液、葛根芩连汤煮散剂、葛根芩连汤发酵液均由山西中医学院实验中心制备。以上制剂的药物组成及用药比例均为葛根∶黄芩∶黄连∶甘草=8∶3∶3∶2。具体制备方法如下：葛根芩连汤水煎液的制备：将饮片加5倍药物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，纱布粗滤取药液；药渣加4倍药物重量的水，煎煮30 min，纱布粗滤去渣，混合两次药液，水浴50 ℃，浓缩至全方生药量为2 g/ml。葛根芩连汤煮散剂的制备：葛根、黄芩、黄连、甘草分别粉碎为60目的粉末，按照上述用量比例混合均匀，将药物粉末加5倍药物重量的水浸泡30 min后，煎煮30 min，持续搅拌，500 rpm/min，纱布粗滤取药液；药渣加4倍药物重量的水，煎煮30 min，持续搅拌，500 rpm/min，纱布粗滤去渣，混合两次药液，水浴50 ℃，浓缩至全方生药量为2 g/ml。葛根芩连汤发酵液的制备：将葛根芩连汤发酵液离心，取上清液，置于超净工作台，水浴50 ℃，浓缩至1/10时，发酵基质(即药渣)按照上述煮散剂的制备方法，浓缩后与发酵浓缩液合并至全方生药量为2 g/ml。格列美脲片：由上海天赐福生物工程有限公司生产，规格2 mg×30片，批号：20141202。

1.2 试剂链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，批号：1126C0314)来自Sigma S0130，Solarbio 分装；柠檬酸钠(批号：20150116)、柠檬酸(批号：20141108)均购自国药集团化学试剂有限公司；生理盐水(0.9%NaCl，批号：15032411)购自山东华鲁制药有限公司；水合氯醛(批号：20150306)购自天津市光复精细化工研究所；大鼠胰岛素定量elisa试剂盒(批号：20150730)购自上海瓦兰生物科技有限公司；总超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(批号：20150728)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(批号：20150415)、过氧化氢酶(CAT)测定试剂盒(批号：20150608)、谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-px)测定试剂盒(批号：20150512)、考马斯亮蓝法蛋白检测试剂盒(批号：20150608)均购自南京建成生物工程研究所。

1.3 动物Sprague Dawley(SD)大鼠，85只，SPF级，雄性，180～220 g/只，购自中国食品药品检定研究院，合格证号：SCXK(京)2014-0013。

1.4 饲料高糖高脂饲料(配方：猪油10%，蔗糖5%，蛋黄粉5%，胆固醇1%，胆盐0.1%，基础饲料78.9%，批号：20150328)，购自北京诺康源有限公司)；常规饲料(大小鼠生长繁殖饲料，批号：15033151)，购自北京科澳协力饲料有限公司。

2 方法

2.1 造模方法动物购置后适应性喂饲1周，除随机选取10只喂饲常规饲料外，其余75只喂饲高糖高脂饲料4周，在第5周的第1天早晨，空腹腹腔注射STZ溶液35 mg/kg/次，喂饲常规饲料的大鼠注射柠檬酸缓冲液。7 d后大鼠尾尖取血采用血糖仪检测空腹血糖，血糖值≥11.1 mmol/L者视为造模成功。

2.2 分组及处理喂饲常规饲料的10只大鼠继续喂饲常规饲料，作为正常对照组，灌胃给予生理盐水。将造模成功的T2DM大鼠随机分为5组，分别为模型对照组、阳性药对照组、葛根芩连汤水煎液组(以下简称GGQLT水煎液组)、葛根芩连汤煮散剂组(以下简称GGQLT煮散剂组)、葛根芩连汤发酵液组(以下简称GGQLT发酵液组)，仍喂饲高糖高脂饲料，分别灌胃给予生理盐水、格列美脲(0.67 mg/kg)、葛根芩连汤水煎液(生药量为20 g/kg)、葛根芩连汤煮散剂(生药量为20 g/kg)、葛根芩连汤发酵液(生药量为20 g/kg)，持续8周。末次给药后，各组动物禁食12 h，腹腔注射5%水合氯醛，麻醉后腹主动脉采血，静置30 min，2500 rpm/min离心10 min，分离血清并分装，-20 ℃冰箱保存备用。取血后，剪取右大腿股四头肌放冻存管中，迅速置于液氮中，待检。

2.3 检测指标

2.3.1 空腹血糖(FBG)分别于造模(注射STZ)前1天，及造模成功后当天(第0周)与第2、4、6、8周的第7天早晨(禁食12 h后)尾尖取血采用血糖仪测定FBG。

2.3.2 空腹胰岛素(FINS)、胰岛素敏感指数(ISI)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)FINS采用双抗体夹心ELISA法，计算ISI= Ln[1/(FBG×FINS)]，HOMA-IR=FBG×FINS/22.5

2.3.3 氧化应激指标血清超氧化物歧化酶(SOD)采用黄嘌呤氧化酶法(羟胺法)；血清丙二醛(MDA)含量采用TBA法；血清过氧化氢酶(CAT)采用可见光法；血清谷胱甘肽过氧化氢酶(GSH-px)采用比色法。

3 结果

3.1 葛根芩连汤发酵液对T2DM大鼠FBG的影响造模前，各组FBG均在5.0～6.5 mmol/L，且各组间差异无统计学意义。造模后的各组FBG与正常对照组相比均显著升高(P<0.01)，且各组FBG均值>11.1 mmol/L，符合T2DM的诊断标准，说明该模型大鼠造模成功。随着给药时间推移，给药组FBG均有降低趋势，至第4周，阳性药对照组、GGQLT水煎液组及GGQLT发酵液组大鼠FBG显著低于模型对照组(P<0.05)；第6周，各给药组FBG均显著低于模型对照组(P<0.05)；第8周，各给药组FBG均显著低于模型对照组(P<0.01)，其中GGQLT发酵液组FBG均值低于其余给药组，但差异无统计学意义。葛根芩连汤不同剂型降糖作用存在一定的时-效关系。见表1。

表1 各组大鼠FBG比较 (只，

3.2 葛根芩连汤发酵液对T2DM大鼠FINS、ISI、HOMA-IR的影响模型对照组与正常对照组相比，FINS水平显著升高(P<0.01)，ISI显著降低(P<0.01)，HOMA-IR显著升高(P<0.01)，说明模型对照组出现了高胰岛素血症及胰岛素抵抗。各给药组与模型对照组相比，FINS显著降低(P<0.01)，ISI显著升高(P<0.01)，HOMA-IR显著降低(P<0.01)。GGQLT发酵液组FINS水平显著低于其余给药组(P<0.01)；GGQLT发酵液组ISI均值高于其余给药组，但差异无统计学意义；GGQLT发酵液组HOMA-IR显著低于GGQLT水煎液组(P<0.05)，GGQLT发酵液组HOMA-IR均值低于阳性对照药组、GGQLT煮散剂组，但差异无统计学意义。见表2。

表2 各组大鼠FINS、ISI、HOMA-IR比较 (只，

3.3 葛根芩连汤发酵液对T2DM大鼠氧化应激的影响模型对照组血清MDA含量显著高于正常对照组(P<0.01)，SOD及CAT活性显著低于正常对照组(P<0.05，P<0.01)，GSH-px低于正常对照组，但差异无统计学意义。阳性药对照组、GGQLT水煎液组、GGQLT煮散剂组及GGQLT发酵液组SOD活性显著高于模型对照组(P<0.01)。GGQLT发酵液组SOD活性显著高于阳性药对照组、GGQLT水煎液组、GGQLT煮散剂组(P<0.05，P<0.01)。阳性药对照组、GGQLT水煎液组、GGQLT煮散剂组及GGQLT发酵液组MDA含量显著低于模型对照组(P<0.05，P<0.01)。GGQLT煮散剂组及GGQLT发酵液组MDA含量低于阳性药对照组，但差异无统计学意义。GGQLT煮散剂组CAT活性显著高于模型对照组(P<0.05)，阳性药对照组、GGQLT水煎液组及GGQLT发酵液组CAT活性均有升高趋势，但差异无统计学意义。阳性药对照组、GGQLT水煎液组、GGQLT煮散剂组及GGQLT发酵液组GSH-px活性较模型对照组有升高趋势，但差异无统计学意义。见表3。

表3 各组大鼠血清氧化应激指标比较 (只，

4 讨论

氧化应激是指机体受到各种有害刺激后，体内高活性分子如活性氧(Reactive oxygen species，ROS)和活性氮(Reactive nitrogen species，RNS)产生过多，打破了机体氧化系统和抗氧化动态平衡，抗氧化能力下降，造成机体组织细胞及蛋白质、脂质、核酸等生物大分子氧化损伤的一种严重的应激状态，从而导致组织细胞损伤[1]。

氧化应激标志物是一系列能反映机体内氧化应激水平的生物化学物质。脂质过氧化水平常被作为反映氧化应激水平的指标之一，能反映机体受氧化应激损伤的程度。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化成活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用，使之攻击生物膜中的不饱和脂肪酸，导致脂质过氧化作用，同时产生脂质过氧化物，造成细胞损伤[2]。目前用于检测的主要产物为丙二醛(malondialdehyde，MDA)。MDA 含量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接反映出细胞损伤的程度。

机体内存在着两类抗氧化系统，一类是酶抗氧化系统，现在广泛研究的抗氧化酶类包括：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-px)等，可以阻止新的自由基生成，或者清除已经生成但尚未发生反应的自由基；另一类是非酶抗氧化系统，包括维生素C、维生素E等[3]。

研究表明，氧化应激与T2DM密切相关，是引起T2DM发生发展的重要因素[4]。高血糖是产生氧化应激的重要因素，可增加机体内的 ROS 与RNS 含量，主要是通过葡萄糖自氧化、线粒体电子传递链和多元醇通路等途径产生，当超氧化产物的产生速率超过其移除速率时即会产生氧化应激[5，6]。氧化应激会导致胰岛β细胞功能损伤及外周胰岛素抵抗，诱发糖尿病的形成，严重者更会导致糖尿病神经病、糖尿病视网膜病和糖尿病心血管病等多种并发症的形成[7-9]。

氧化应激也是导致胰岛β细胞功能衰退的主要原因之一，其机制可能为：①ROS 可直接损伤β细胞，主要是以破坏细胞线粒体结构为特点，进一步促进β细胞凋亡[10]；②抑制胰十二指肠同源盒因子1(PDX-1)的活性，如C-Jun氨基末端激酶(C-jun N-terminal kinase，JNK)的过度激活可降低PDX-1的活性，改变其磷酸化状态，引起PDX-1与DNA的结合力下降，造成胰岛素基因转录障碍和β细胞功能减退，导致胰岛素合成和分泌减少等[11，12]；③ ROS可激活核转录因子κB(NF-κB)等胰岛素信号通路，间接损伤β细胞功能，如引起β细胞炎症反应[13]；④影响细胞能量代谢：如降低3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的活性，抑制了糖酵解过程和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)穿梭系统，致使ATP合成不足，使葡萄糖刺激的胰岛素第一时相分泌减少[14]。

大量基础研究已经表明氧化应激是糖尿病发病中的关键因素之一，改善氧化应激状态为防治糖尿病及其慢性并发症提供了新的视角。“抗氧化”是现代医学的概念，因此在开展中药复方抗氧化活性基础研究及临床研究时无法借鉴古人的经验，且复方研究又受到如炮制、提取、溶剂、贮存等诸多因素的影响，若仅仅根据中药药理研究的结果选择药物，又不符合中医辨证论治的思想。因此尽量选择药味精炼的中药复方，通过基础及临床研究，观察中药复方抗氧化活性，将有益于改善氧化应激，从而更好地防治糖尿病及其慢性并发症。

方药防治糖尿病在过去几十年的药理研究中，总是局限于观察降糖疗效为主，随着氧化应激与糖尿病相关性的研究进展，本研究着重于观察葛根芩连汤对于2型糖尿病大鼠的抗氧化活性。

本实验模型对照组与正常对照组比较，SOD、GSH-px、CAT活性均升高，MDA含量降低，说明T2DM与氧化应激之间存在直接或间接关系。T2DM发病后，持续的高血糖可进一步加重氧化应激，而氧自由基的大量堆积，又反过来加重T2DM的病情，相互影响。糖尿病产生过多的自由基，消耗了内源性SOD、GSH-px、CAT，SOD、GSH-px、CAT发生糖基化后活性下降，抗氧化能力降低，氧自由基通过与细胞膜不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，破坏了细胞结构和功能，同时形成MDA。

给予模型大鼠葛根芩连汤发酵液8周后，可以显著升高T2DM大鼠血清SOD 活性，降低 MDA 含量，对CAT及GSH-px活性有升高趋势。GGQLT发酵液组SOD活性显著高于阳性药对照组、GGQLT水煎液组、GGQLT煮散剂组，GGQLT发酵液组MDA含量均值低于阳性药对照组。研究结果证实，葛根芩连汤发酵液可通过提高模型大鼠抗氧化物酶的活性和降低脂质过氧化物的含量，从而增强自由基清除能力和降低ROS的产生，起到抗氧化应激、防止氧化损伤的效果，最终达到抗糖尿病、保护胰岛β细胞功能，改善胰岛素抵抗的作用。分析其原因，可能是由于葛根芩连汤方中四味药均有抗氧化作用，经过复方配伍后发生协同作用而产生。发酵也是其增效的重要因素，通过发酵，复方中的大分子物质可以转化为小分子物质，更有利于机体的吸收。