王佩佩 ，孙惠敏，曹丽翠，刘 丽，李占涛，王娜琳，贾孟辉 ，3，王晓丽*

（1.银川市第一人民医院，宁夏 银川 750001；2.宁夏回族自治区中医医院暨中医研究院，宁夏 银川 750021；3.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004）

血管性痴呆（vascular dementia，VaD）是以缺血性脑血管病为基础引起的广泛持续性的脑损害，主要症状为学习记忆功能减退，伴或不伴有语言、视空间能力及情感或者人格障碍等的痴呆综合征，是仅次于阿尔海默茨病的第二大类痴呆疾患［1］。研究发现，临床中30%的脑卒中患者3 年内易进展为血管性认知功能障碍［2］。据统计，老年人患缺血性脑血管疾病逐年增加，并发血管性痴呆的发病率呈上升趋势，患病率为1.1%～3.0%，严重影响着老年患者的身心健康和生活质量，同时给家庭及社会带来沉重的经济负担［3］。本实验在前期研究基础上探讨失荅剌知丸改善血管性痴呆大鼠学习记忆能力的作用机制，现报道如下。

1 实验材料

1.1 动物 SPF级SD大鼠78只，2～3个月龄，体质量（200±50）g；购于并统一饲养在宁夏医科大学SPF 级动物实验中心，自由进食和饮水；常规环境适应性饲养1周后开始实验。

1.2 药物 尼莫地平（拜耳医药保健有限公司，规格：每片20 mg，国药准字H20003010），临用时研细加蒸馏水配制浓度为1.08 mg/ml的混悬液。失荅剌知丸药物组成：柴胡31 g，黑诃子31 g，芦荟62 g，失荅剌知（延胡索）6 g，石菖蒲6 g，番盐6 g，沙哈木罕荅里（药西瓜）9 g，阿里公（松蕈）9 g，安息香9 g，撒额冰（阿魏）9 g，干姜9 g，荜茇9 g，胡椒9 g，白芥子9 g，芸香9 g，巴豆霜9 g。根据人与大鼠用药的换算关系，将以上药物水煎至含生药量为2.03 g/ml 的浓缩液，4 ℃冰箱保存备用。

1.3 试剂与仪器 Bio-swamp 兔多克隆抗体NR1（货号：PAB43205-P，武汉华联科生物技术有限公司）；ABclonal兔多克隆抗体NR2B（批号：A0924，武汉爱博泰克生物科技有限公司）；DAB 显色试剂（北京中杉金桥生物技术有限公司）；Bio-swamp 生物素标记的山羊抗兔（货号：PAB160011，武汉华联科生物技术有限公司）；mini protean 3 电泳仪（cellBIO-RAD）；MK3 酶标仪（芬兰雷勃公司），干式恒温器（杭州奥盛仪器有限公司），Centrifuge 5424R 离心机（德国艾本德股份公司），Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能科技有限公司）。

2 方 法

2.1 血管性痴呆模型建立方法 采用双侧颈总动脉结扎法（2-VO）制备大鼠血管性痴呆模型。术前大鼠禁食，自由饮水。腹膜内注射10%水合氯醛麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定在实验台，颈部去毛消毒，沿颈部皮肤正中线剪开，顿性分离颈总动脉，用4号丝线行颈总动脉结扎，拉紧丝扣，阻断血流20 min 后放松丝扣再灌注10 min，再次阻断血流20 min，第2 次再灌注后观察30 min，局部组织缝合。手术后予以青霉素腹腔内注射，预防伤口感染。通过Morris水迷宫法试验，记录每只大鼠平均逃避潜伏期，求得假手术组平均值与标准差，平均逃避潜伏期大于此值的大鼠判为学习记忆功能障碍，造模成功。

2.2 分组与给药 78 只SD 大鼠随机分为空白组6只、假手术组18只、模型组18只、尼莫地平组18只、失荅剌知丸组18只。空白组不予手术操作，假手术组只分离颈总动脉，模型组及用药组采用双侧颈总动脉结扎法制备大鼠血管性痴呆模型。各组大鼠造模成功后均按10 ml/kg 剂量给药，失荅剌知丸组予含生药浓度2.03 g/ml 的失荅剌知丸药液灌胃，尼莫地平组予浓度1.08 mg/ml的尼莫地平混悬液灌胃，空白组、假手术组和模型组给予等容积生理盐水灌胃，同一时间给药，每日2 次。除空白组外，余4 组根据灌胃15 d、30 d、45 d时间点分别处死动物6只。

2.3 Western blot 法检测海马区 NR1 和 NR2B 受体蛋白表达 麻醉大鼠，轻取大鼠海马区脑组织，将脑组织剪细小碎片，加入裂解液，匀浆裂解后的样品4 ℃12 000 g 离心15 min，取上清液进行蛋白质定量后贮存于-80 ℃冰箱。采用BCA 法进行蛋白定量后用SDS-PAGE 法行蛋白分离，再行湿转转膜，室温下将膜用5%的脱脂牛奶封闭2 h，封闭液稀释一抗，4 ℃孵育过夜。第二日室温下TBST 洗膜3次，每次5 min，之后加入1∶3 000 稀释二抗，室温下孵育30 min 后，用TBST 洗膜3 次，每次5 min。ECL 化学发光法检测后将膜置于发光检测仪中检测，用TANONGIS 软件读取条带灰度值。

2.4 统计学分析 采用SPSS 20.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，符合正态分布者采用单因素方差分析，多组间比较，当方差齐时用LSD法比较，方差不齐时用Dunnett’s T3 法比较，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

失荅剌知丸对血管性痴呆大鼠NR1、NR2B 蛋白表达的影响见表1、图1、图2。

图1 各组NR1蛋白表达条带图

图2 各组NR2B蛋白表达条带图

表1 失荅剌知丸对VD大鼠NR1、NR2B蛋白表达的影响 （，n=6）

表1 失荅剌知丸对VD大鼠NR1、NR2B蛋白表达的影响 （，n=6）

注：与空白组、假手术组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与尼莫地平组15 d 比较，③P＞0.05；与尼莫地平组30 d比较，④P＜0.05；与尼莫地平组45 d比较，⑤P＜0.05

NR2B 0.38±0.021 0.37±0.015 0.34±0.027①0.49±0.019②0.55±0.012②⑤组 别空白组假手术组模型组尼莫地平组失荅剌知丸15 d NR1 0.33±0.012 0.34±0.011 0.30±0.024①0.54±0.010②0.55±0.011②③NR2B 0.38±0.021 0.42±0.018 0.33±0.007①0.59±0.039②0.66±0.081②③30 d NR1 0.33±0.012 0.30±0.009 0.27±0.010①0.42±0.009②0.51±0.032②④NR2B 0.38±0.021 0.39±0.026 0.21±0.036①0.50±0.016②0.54±0.009②④45 d NR1 0.33±0.012 0.32±0.013 0.25±0.020①0.37±0.012②0.46±0.030②⑤

结果显示：与空白组、假手术组比较，模型组NR1、NR2B 蛋白表达明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，尼莫地平组和失荅剌知丸组NR1、NR2B 蛋白的表达明显升高（P＜0.05）；尼莫地平组15 d 和失荅剌知丸组15 d NR1、NR2B 蛋白的表达无显著性差异（P＞0.05）；与尼莫地平组 30 d、45 d 比较，失荅剌知丸组30 d、45 d NR1、NR2B蛋白表达明显升高（P＜0.05）。

4 讨 论

血管性痴呆的发病过程及病理机制极为复杂，突触传递信息功能损伤是VaD 学习记忆和认知障碍的重要原因［4］，突触功能改善被认为是减轻VaD 学习和认知功能损伤的有效作用机制［5］。NMDA 是与突触可塑性诱导密切相关的一种离子型谷氨酸受体，对突触可塑性的调控中起着关键作用，参与学习和记忆的产生和维持功能［6］。NMDA 受体主要包括3 种亚型，分别是NR1，NR2（NR2A、NR2B、NR2C、NR2D）和NR3（NR3a、NR3b），广泛分布在中枢海马部位，其亚基NR1 和NR2B 与学习记忆密切相关。研究发现，小鼠的学习记忆能力下降与NR1基因缺失相关，说明小鼠学习能力的损害由NR1基因缺失导致；同时电生理离体结果证实，小鼠学习能力障碍与NR1基因缺失引起小鼠前额叶脑区LTP受损密切相关［7］。宫晓洋等［8］研究证实，经滋补脾阴方治疗脾阴虚痴呆组大鼠后其记忆与学习能力提升，其可能的作用机制是滋补脾阴方使NR1 蛋白表达量增加，从而起到抗痴呆、抗衰老的作用。NR2B 基因缺失可以损害学习记忆能力，通过转基因技术过表达NR2B受体发现小鼠突触电位的易化、学习能力和信息保留能力均较前明显改善［9］。研究证实，大鼠学习记忆能力下降与NR2B 亚基表达减少相关，给予上调NR2B 亚基表达的药物可使长时程作用增强，从而改善痴呆大鼠学习记忆能力［10］。本实验研究结论和上述研究结果基本一致，失荅剌知丸能上调血管性痴呆大鼠的NR1和NR2B蛋白的表达。

清·刘智《天方性理》记载：“脑是为百脉之总原，而百体之知觉运动皆赖焉。”［11］回医理论认为人体的生命活动、感觉和运动、思维和心理皆由脑主宰，且详细记载人体的总觉、回忆、思虑、判断、识记等五种不同思维活动的发生，与大脑的脑前、脑前之后、脑中、脑中之后和脑后不同结构区域依次相对应。回医理论认为血管性痴呆的主要病因病机由禀性衰败、四液质（脑白液质、脑黑液质、脑黄液质、脑红液质）失调、脑偏干和脑偏湿所致，治疗原则以芳香开窍醒神为主，且用药多以热性、干性的芳香药为主。失荅剌知丸方出自《回回药方》“众风门”篇，本研究组前期研究证实失荅剌知丸能改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力［12］，其改善学习记忆的作用机制尚不清楚。因此，本文在前期实验基础上观察失荅剌知丸对血管性痴呆大鼠NMDA 受体（NR1、NR2B）的表达，结果显示失荅剌知丸能改善血管性痴呆大鼠的学习记忆能力，其可能作用机制是上调NR1、NR2B蛋白的表达。