张国梁，吴 江，王佳琦，魏 巍，宋振宇，任宝瑞

(佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002)

近年来，口腔癌症已经成为全球性健康难题之一[1]。我国的口腔癌主要以口腔鳞状细胞癌为主，约占口腔癌的95%，是世界上12种最常见的口腔恶性肿瘤之一[2,3]。口腔鳞状细胞癌以分化和淋巴结转移为特征，易出现区域淋巴结转移或远处转移，具有明显的高侵袭性的鳞状上皮细胞癌[4,5]。主要发生于舌、牙龈、颊黏膜、唇黏膜、腭部、上颌窦等部位[6,7]。其中舌鳞状细胞癌在OSCC中最常见，具有典型性特点，多发生于舌缘、舌尖、舌背部位。患者预后差，生存率低，而且OSCC晚期患者会影响咀嚼、呼吸、吞咽等口腔功能，严重影响患者的生活质量[8～10]。因此，研究口腔鳞癌的转移发生机制，具有一定的临床意义。

20世纪70年代，Kato等从子宫颈鳞状细胞癌中分离出一种肿瘤特异性抗原，最初命名为“TA-4”，又称为鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen， SCCA)，属于内源性蛋白酶抑制剂的SERPIN家族成员，与子宫颈鳞状细胞癌晚期密切相关[11]。具有抑制溶酶体组织蛋白酶作用的SERPINB3，在子宫颈、食管、头颈部、舌、肝脏等粘膜上皮鳞癌中高表达，但在上述部位的正常鳞状上皮细胞中呈现不表达或低表达[12,13]。关于SERPINB3基因在口腔鳞癌转移的研究甚少，本研究主要探讨SERPINB3基因与口腔鳞状细胞癌转移的相关性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人舌鳞状细胞癌细胞系(TCA8113)。含SERPINB3 shRNA的慢病毒购自Genecopoeia, 其作用靶点分别为：shRNA1: 5’-GATGAGGCAATACACATCTTT-3’；shRNA2：5’-GCACAACAGATTAAGAAGGTT-3’；shRNA3:5’-GGTAATATTGGCAGCAATACC-3’。三个质粒中均含有嘌呤霉素抗性基因及EGFP标签。

1.2 细胞培养

利用含10 %胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养TCA8113细胞。每隔3天传代一次，以保证细胞的活性状态。

1.3 SERPINB3基因敲低稳转细胞系的筛选

将TCA8113细胞按照2.0×105个细胞/孔的量接种于6孔板中，培养16h后，待细胞汇合度达到60%～70%时，进行SERPINB3 shRNA慢病毒转染，具体步骤如下：

将TCA8113细胞在4℃条件下冷冻处理2h；转染前，利用完全培养基将病毒稀释至适当的浓度(每孔加入病毒4.5μL(2.08×108TU/mL)，MOI ≈ 1)，同时加入Polybrene(索莱宝，货号：H8761)至其终浓度为5μg/mL，充分混合均匀；利用PBS对细胞清洗三次；加入上述稀释好的含病毒颗粒的培养基，将细胞在37℃，5% CO2条件下继续培养12h后，将培养基更换为新鲜的不含病毒的完全培养基；在37℃，5% CO2条件下培养72h后，加入终浓度为1μg/mL的嘌呤霉素；再培养24h，待未转染的细胞完全死亡后，更换培养基为新鲜的完全培养基，继续培养直至细胞长满培养皿，即得SERPINB3基因被稳定敲低的细胞系。

1.4 Western blotting检测

首先收集细胞，加入含PMSF的RIPA 裂解液获得细胞总蛋白，进行BCA定量，蛋白电泳、转膜，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，根据ECL发光试剂盒实验步骤进行显影和定影，照相，并进行数据分析。选用的内参基因为鼠抗人β- Actin (Abcam, ab6276)，兔SERPINB3抗体(Abcam, ab154971)。目标基因SERPINB3曝光、显影后，再依次用蒸馏水处理10min，0.2 M NaOH处理10min，蒸馏水处理10min，把SERPINB3抗体剥离，之后再从封闭那步开始，然后孵育抗体β-Actin，曝光、显影。

1.5 划痕实验

实验分组为Control组和SERPINB3敲低组，将野生型TCA8113细胞系以及SERPINB3 shRNA稳转细胞系分别按照3.5×105个细胞/孔的量接种于6孔板，培养16h后，利用无菌吸头均匀地在培养皿中进行划线。利用PBS对细胞清洗3次后，更换为新鲜的完全培养基，并分别测量0h、24h、48 h划痕的宽度，最后根据划痕宽度变化评估细胞迁移能力的改变，具体公式如下：

迁移率 =(0h宽度 -t时间宽度)/ 0h宽度，其中t为划痕宽度检测的时间点。

最后，将上述所得实验数据利用GraphPad Prism 6.0软件分析。

1.6 细胞迁移能力检测实验Transwell实验

实验分组为Control组和SERPINB3敲低组。实验开始前，以1:8的比例稀释基质凝胶，并涂覆Transwell室底膜的上表面，室温风干5h后，加入50μL 含0.1% BSA的无血清DMEM培养基并于37℃条件下孵育30min以水化基质胶，用于后续实验。按照4×104个细胞/孔的量分别将野生型TCA8113细胞以及SERPINB3敲低型细胞接种于Transwell小室中，其中上层培养液为100μL含0.1% BSA的无血清DMEM培养基，下层为700μL含10%胎牛血清的完全培养基。37℃、5% CO2条件下培养24h后，利用医用棉签轻轻擦去上层细胞。PBS清洗细胞3次后，利用甲醇固定20min，并再次利用PBS对细胞清洗3次。利用0.1%的结晶紫染色10min。PBS溶液冲洗3次。然后在荧光显微镜下观察。选择不同视野进行对比，判断SERPINB3 敲低对细胞侵袭能力的影响。最后，将上述所得实验数据进行GraphPad Prism 6.0软件分析。

2 结果

2.1 Western blotting检测SERPINB3 shRNA的慢病毒转染情况

含SERPINB3 shRNA的慢病毒转染48h后，TCA8113细胞中SERPINB3蛋白的表达情况。在与空白对照Control组的蛋白表达对比发现，SERPINB3 shRNA3慢病毒质粒能够有效的减弱SERPINB3在TCA8113细胞中的表达。因此，后续的实验选用SERPINB3 shRNA3稳转细胞系作为实验组细胞。见图1。

图1 SERPINB3 shRNA的慢病毒转染48h后SERPINB3表达

2.2 划痕实验结果

通过创伤愈合实验确定SERPINB3 敲低对细胞迁移的影响。按照质粒转染后0h、24h、48h3个时间段，分别对质粒转染24h、48h后创口宽度变化比值所绘制的柱状图，见图2，根据创面愈合大小定量分析，结果发现SERPINB3敲低后，细胞的创口愈合速度明显受到抑制，结果证明SERPINB3的表达与舌鳞状细胞癌的迁移有一定相关性。数据使用Graph Pad Prism软件处理，并用平均值±标准差表示，n=3，和对照组相比，有统计学意义(***P<0.001)。

图2 SERPINB3 敲低后细胞迁移能力变化(200μm，40×)

2.3 Transwell实验

Transwell试验是根据通过基质凝胶的细胞数量来判断毒性质粒对细胞侵袭能力的影响。相同时间内，细胞透过基质胶的数量越少，则表明毒性质粒对细胞的侵袭和迁移能力抑制作用越强。见图3，显微镜下观察到SERPINB3 敲低后，穿过基质凝胶的细胞明显比Control组细胞的数量少，从而证明SERPINB3的表达与舌鳞状细胞癌的侵袭有一定相关性。数据使用Graph Pad Prism软件处理，并用平均值±标准差表示，n=3，和对照组相比，有统计学意义(***P<0.001)。

图3 SERPINB3敲低后细胞侵袭能力变化(50μm，200×)

3 讨论

在上皮源性鳞癌症发展过程中，SERPINB3可以抑制癌细胞凋亡，绕过细胞死亡的通路机制，促进肿瘤的生长、转移、扩散及预后恶化。SERPINB3的重要致癌特征是诱导上皮间充质转化。有研究发现当上皮源性鳞癌细胞在缺氧环境下借助低氧诱导因子HIF-2α诱导后，发现SERPINB3能够促进EMT和转化生长因子生成，并且成为肿瘤侵袭和转移的关键[14]。在子宫颈鳞状细胞癌和食管鳞状细胞癌中，发现SERPINB3的表达水平与肿瘤浸润和淋巴结转移的频率相一致[15]。有研究通过向HepG2细胞系和MDCK细胞系中分别添加上调外源重组SERPINB3蛋白，发现SERPINB3的表达上调会导致转染细胞出现细胞簇状且连接松散，细胞形态呈细长形改变，并且证明这些改变与减少E-cadherin钙粘蛋白和增加β-catenin平行增加相关[16]。由此可见，SERPINB3的表达上调与癌细胞的EMT密切相关，通过抑制细胞凋亡来促进细胞存活，增加细胞增殖并诱导上皮-间充质转化，加速癌细胞的侵袭和转移，提高癌细胞的增殖能力。本研究提示通过shRNA基因干扰技术，发现SERPINB3敲低能够抑制人舌鳞状细胞癌的转移，SERPINB3基因有可能成为基因治疗口腔鳞癌的靶点，为建立肿瘤特异性基因调控自杀基因成为靶向毒素体系提供了实验依据。