吴 江，张国梁，刘连升，郭 琼，任宝瑞，宋振宇，刘继光，施 维

(1.佳木斯大学口腔医学院，黑龙江 佳木斯 154002；2.吉林大学生命科学学院 分子酶学工程教育部重点实验室，吉林 长春 130012)

目前，口腔癌已经成为全球性健康难题之一[1,2]。口腔恶性肿瘤中主要以舌鳞癌最为常见。基因治疗在恶性肿瘤研究方面尚处于尝试性实践研究阶段。基因治疗主要是以改变靶细胞遗传物质为基础，将外源基因导入靶细胞，最终达到治疗疾病目的的生物医学治疗手段[3,4]。外源毒素基因属于外源基因中的自杀基因，其具有持久、稳定、有效杀死靶细胞的优势[5～9]。铜绿假单胞菌外毒素(pseudomonas aeruginosa exotoxin，PE)是可利用的外源毒素之一，属于自杀基因。实验中选用的毒素基因PE38KDEL是一种广泛应用于肿瘤治疗的非特异性分子细菌毒素PE的衍生物，具有相对分子量较小、杀伤力强、免疫原性小的特点[10～12]。

实验前期已经根据SERPINB3基因在人舌鳞状细胞癌中表达的特异性，利用基因重组技术成功构建以SERPINB3启动子调控的PE38KDEL毒素质粒，并且已经通过体外细胞实验验证了SERPINB3启动子在舌鳞癌细胞中具有强表达活性；pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒可以靶向抑制TCA8113细胞蛋白合成，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖、侵袭及迁移。本实验在细胞实验的基础上，通过构建人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型，经过质粒体内转染进一步验证pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒具有靶向抑制舌鳞癌的可行性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人舌鳞状细胞癌细胞系(TCA8113)为吉林大学生命科学院施维教授提供。SPF级，5周龄，裸鼠BALB/c-nu许可证号：SCXK(京)2016-0006，北京维通利华实验动物技术有限公司。奥林巴斯显微镜(Olympus OPTICAL CO.,LTD)，流式细胞仪(BD)，Annexin V-FITC PI 双染细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博生物)，TUNEL试剂盒(北京中杉)，免疫组化试剂盒(福州迈新)，Ki-67抗体(NO. ab16667，ABCAM)，DAB显色剂(福州迈新)，复合消化液(武汉博士德)。

1.2 人舌鳞状细胞癌皮下异位瘤移植BALB/c-nu小鼠模型的构建

将 5周龄BALB/c-nu裸鼠15只随机分成3组，每组5只小鼠，组别是空白对照组(注射生理盐水)、pGL3-Basic阴性质粒组、pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒。用带有6号针头的1mL注射器，将事先用PBS溶液配置好的人舌鳞状细胞癌TCA8113细胞悬液接种于小鼠腹股沟中上部皮下，每只小鼠注射0.1mL(细胞个数为1×106)。每3天观测记录肿瘤大小1次，肿瘤体积用游标卡尺测量，按体积计算公式 肿瘤体积v= ab2/2(a为肿瘤最长径，b为与a垂直的最长短径，体积单位为mm3)计算肿瘤体积并测量小鼠质量，并且观察小鼠生长状态。

1.3 质粒体内转染

当肿瘤平均体积达到50mm3时，进行体内转染。转染质粒用量根据小鼠体重，按照0.625mg质粒/kg计算，质粒与转染试剂PEI的用量=1:1.33的比例进行计算，分别配制相应的质粒与PEI溶液，静置5min，再将PEI溶液缓慢加入质粒溶液中，37℃孵育30min，质粒与PEI形成复合物后，用作体内转染备用。空白对照组按照质粒的计算方式注射相应的生理盐水。每3天给药1次，并观测记录肿瘤体积1次，电子天平称量裸鼠体重1次。

1.4 动物处死及标本收集

待模型鼠空白对照组的肿瘤平均体积接近1500mm3时，及时对小鼠进行处置。小鼠处理的具体步骤如下：用颈椎脱臼法处死所有小鼠，用眼科剪刀、镊子等手术器械将肿瘤组织、相关重要脏器(心、肝、脾、肺、肾)剥出，生理盐水清洗后，迅速置于事先准备好的10 %的中性缓冲甲醛固定液中固定，经过梯度乙醇脱水，将组织块浸入石蜡中浸蜡、包埋，制成标本蜡块，切成石蜡切片，检测备用。

1.5 HE 染色观察

样本取自空白对照组、pGL3-Basic阴性质粒组、pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒组的为心、肝、脾、肺、肾、肿瘤组织标本蜡块，切成石蜡切片后并进行HE染色后，每张随机选取5个视野，显微镜下观察组织变化情况。

1.6 TUNEL检测

样本取自空白对照组、pGL3-Basic阴性质粒组、pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒三个实验组的小鼠肿瘤组织标本的石蜡切片，利用TUNEL检测试剂盒步骤进行，通过对比观察。根据显微镜下细胞的结构，染色体、细胞核等的情况进而观察经过质粒转染后肿瘤组织的细胞状态，评估pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒是否对能够在小鼠体内靶向诱导口腔鳞状细胞癌的细胞凋亡。

1.7 Ki-67免疫组化

样本取自空白对照组、pGL3-Basic阴性质粒组、pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒的小鼠肿瘤组织标本的石蜡切片。进行Ki-67免疫组化检测，每张随机选取5个视野，显微镜下观察。根据Ki-67抗原在肿瘤细胞中的表达情况，验证通过体内转染pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒靶向诱导口腔鳞状细胞癌的细胞凋亡。

2 结果

2.1 pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒在舌鳞状细胞癌(TCA8113)皮下异位瘤移植BALB/c-nu小鼠模型体内的抑瘤作用

图1所示，实验周期共16d，空白对照组平均肿瘤体积最终达到1479.21mm3终止给药。此时，pGL3-Basic组与空白对照组肿瘤生长情况相似，16d内平均肿瘤体积达到1183.56mm3，pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒组16 d内平均肿瘤体积达到582.22mm3。此外，荷瘤小鼠的体重及生长状态在治疗过程中各组间无明显波动变化。

(b)

2.2 HE染色结果

图2(a、b、c、d、e)结果所示，发现心、肝、脾、肺、肾5种脏器组织中未见明显的病理变化，细胞形态、结构正常。图2(f)所示，肿瘤组织的HE染色结果发现空白对照组和pGL3-Basic阴性质粒组未见明显细胞凋亡信号，其中细胞核呈深蓝色染色，肿瘤细胞结构完整的比例较高，细胞增殖明显；而pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒组，染色较浅，凋亡细胞密度较高，染色体发生皱缩。

图2 不同质粒体内转染后小鼠各部分组织的HE染色结果(50 μm，20×)

2.3 TUNEL结果

经不同质粒体内转染处理后，舌鳞状细胞癌(TCA8113)皮下异位瘤移植BALB/c-nu小鼠肿瘤组织的TUNEL染色(图3)结果发现空白对照组和pGL3-Basic阴性质粒组未见明显细胞凋亡，细胞呈现蓝色，细胞增殖明显；pSERPINB3-PE38KDEL质粒组中出现大量凋亡的棕色细胞。

图3 不同质粒体内转染后小鼠肿瘤组织的TUNEL染色结果(50 μm，20×)

2.4 Ki-67免疫组化结果

经不同质粒(pGL3-Basic质粒或pSERPINB3-PE38KDEL质粒)体内转染处理后的舌鳞状细胞癌(TCA8113)皮下异位瘤移植BALB/c-nu小鼠肿瘤组织的Ki-67免疫组化结果(图4)发现pSERPINB3-PE38KDEL质粒组的细胞呈现蓝色，Ki-67的表达减少，细胞凋亡明显；而pGL3-Basic质粒组与空白对照组呈现大量的棕色细胞，Ki-67的表达增加，细胞呈现明显的增殖。

图4 不同质粒体内转染后小鼠肿瘤组织的Ki-67免疫组化结果(50 μm，20×)

3 讨论

在成功构建人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤模型的基础上，经过质粒体内转染后，小鼠的体重及生长状态在治疗过程中各组间无明显波动变化，再对小鼠的心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织分别进行研究。HE染色和TUNEL结果说明通过体内转染，pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒在对正常组织部未造成明显损害的情况下，可以靶向诱导舌鳞状细胞癌荷瘤小鼠肿瘤组织的细胞凋亡。Ki-67是一种抗凋亡蛋白，Ki-67抗原的表达水平与细胞增殖成正比，Ki-67抗原的表达量增加，细胞呈现明显增殖，细胞在显微镜下呈现棕色；然而，Ki-67抗原的表达量减少，细胞呈现明显凋亡，细胞在显微镜下呈现蓝色，因此Ki-67免疫组化结果说明pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒可以在体内靶向诱导舌鳞状细胞癌的细胞凋亡。

实验选用的毒素基因PE38KDEL是一种广泛应用于肿瘤治疗的非特异性分子细菌毒素PE的衍生物，属于自杀基因，具有相对分子量较小、杀伤力强、免疫原性小的特点[13,14]。如何实现自杀基因靶向杀死肿瘤细胞是肿瘤基因治疗的研究重点。前期实验根据SERPINB3基因在舌鳞状细胞癌中被选择性激活[15]，并且进行体外细胞验证pSERPINB3-PE38KDEL毒素质粒可以靶向抑制TCA8113细胞蛋白合成，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖、侵袭及迁移。再结合体内动物实验的结果进一步证明SERPINB3启动子具有作为调控自杀基因靶向治疗口腔鳞状细胞癌的毒素质粒启动子的可行性。 本研究提示通过SERPINB3鳞癌特异性启动子调控下的PE38KDEL毒素表达质粒对人舌鳞状细胞癌裸鼠皮下移植瘤的具有靶向治疗的可能性，为建立肿瘤特异性基因调控自杀基因成为靶向毒素体系提供了实验依据。