陈晖宽，黄雪琴，何若云，罗玉琼，陈信伟，罗国庆

(广东医科大学附属医院， 广东 湛江 524001)

喉癌是头颈部常见的一种恶性肿瘤，由于其发病位置较为特殊，严重的影响到患者的生活质量。除常规手术治疗，大部分的喉癌患者需要结合化疗，研究证实顺铂(cisplatin，DDP)是喉癌等相关肿瘤的一线化疗药物，具有良好的治疗效果[1]。然而，伴随长期化疗药物使用喉癌细胞对DDP的敏感性明显降低，严重地影响了DDP的治疗效果[2]。但是目前有关喉癌细胞对DDP耐药的机制尚不完全清楚。细胞凋亡和增殖是肿瘤细胞恶性病变的关键环节，调控凋亡和增殖在肿瘤细胞化疗敏感性中发挥重要作用[3]。赖氨酰氧化酶样蛋白-2(Lysyl oxidase-like 2 protein，LOXL2)最初是从衰老成纤维细胞中分离出来，是一种分泌性蛋白[4]。既往研究发现LOXL2参与了多种肿瘤，如胃癌、食管癌、结直肠癌等细胞侵袭和转移[5]。另外，基因沉默LOXL2能够抑制乳腺癌细胞侵袭和转移，促进细胞凋亡[6]。以上研究表明LOXL2可能是肿瘤发生发展的关键调节分子之一。但是目前有关LOXL2对喉癌细胞凋亡和DDP化疗敏感性的影响尚不清楚。因此，本研究拟通过体外培养喉癌细胞株Hep2，探究LOXL2对细胞凋亡和DDP化疗敏感性的影响，以期为喉癌的治疗提供新的可能性靶标分子。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞与试剂

人喉鳞癌Hep2细胞株(中国科学院上海细胞生物研究所)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒(美国Sigma公司，批号：4030ES20)；MTT检测试剂盒(江苏碧云天生物技术公司，批号：C0009S)；细胞裂解液、胰酶、蛋白酶抑制剂、蛋白marker、BCA试剂盒、一抗稀释液、山羊抗小鼠、山羊抗兔二抗稀释液和ECL发光试剂盒(碧云天生物技术公司)；逆转录试剂盒、SYBR Premix Ex Taq以及TRIzol Reagent(日本Takara公司)；Lipofectamine 2000转染试剂盒(广州锐博生物技术有限公司)；LOXL2兔单克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：9047)；β-actin小鼠单克隆抗体(碧云天生物技术公司，批号：AF5001)；DDP(山东齐鲁制药有限公司)。

1.1.2 主要仪器

细胞匀浆仪(武汉泰普拓公司，型号：TWK-FST32)；高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：Micro17R)；倒置荧光显微镜(日本尼康(Nikon)公司，型号：GPJ9-TS100-F)；全自动多功能酶标检测仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司，型号：FC)；电泳仪(美国伯乐Bio-Rad公司，型号：1658033)；ChemiDoc XRS+成像系统(美国Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组

Hep2细胞采用含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM并置于37℃，5% CO2的细胞培养箱内培养，贴壁生长，待生长融合度达80%～90%时，倾去培养基，PBS润洗2次，采用0.25%的胰蛋白酶消化3min至细胞呈现卵圆形，10% FBS的DMEM细胞培养基终止消化，进行传代处理。实验分为对照组(Control)、转染LOXL2无关片段组(LOXL2-NC)、转染LOXL2 siRNA组(LOXL2-siRNA)以及转染转染Lipofectamine 2000组(Lipofectamine 2000)组。

1.2.2Westernblot检测LOXL2蛋白表达水平

Hep2细胞碾磨，涡旋(5min/次)，冰上裂解1h；之后利用BCA法测定各组细胞蛋白质浓度并按照30μg/孔上样计算得出各组上样体积；制备浓缩胶与分离胶凝胶，上样；电泳90min；湿转转膜120 min；用5%脱脂牛奶室温封闭2 h，孵育对应LOXL2兔单克隆抗体(1：1000)，β-actin小鼠单克隆抗体(1：2000)，4℃过夜，孵育对应的山羊抗小鼠二抗或者山羊抗兔二抗(1：5000)1～2h，；摇床摇晃上加TPBS洗涤3次，5min/次，然后加入显影液，显影并拍照。LOXL2蛋白表达表达水平以目的蛋白条带灰度值与β-actin灰度值相比反映，以上实验重复3次。

1.2.3 MTT实验检测细胞增殖

取对数生长的细胞。将消化后的Hep2细胞按照96孔板密度为：1×104/孔接种，细胞分别贴壁生长24h，每组设置6个复孔，每孔加入MTT溶液10μL(5 mg/mL)继续培养4h，终止培养，弃去细胞上清，每孔加入150μL的DMSO震荡10min，使得充分溶解，酶标仪设定波长为570nm检测各孔的吸光度值，以OD值反应细胞的增殖活力。细胞增殖率(%)=各处理组细胞OD/对照组OD值×100%。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集各组细胞，PBS润洗3遍，离心后倾去细胞液，细胞重悬将浓度调整为1×105/mL。按照Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒说明书操作，在488nm处，分别激发525nm和620nm带孔滤波器，检测FITC和PI荧光，从而得到5组细胞的凋亡情况。

1.2.5 平板克隆形成实验

取对数生长期Hep2细胞，按照5×105个/孔浓度接种于6孔板内，每组各5个复孔，细胞贴壁生长24h，按照1.2.1方法分组，待细胞生长密度80%～90%时，对上述各组细胞加入DDP干预处理，终浓度为0.00、0.01、0.10、1.00以及10.00mg/L。胰蛋白酶消化处理并将各组细胞吹打成单个细胞，并按照50、100以及200个细胞/培养皿梯度稀释后进行集中培养，轻轻晃动培养皿使细胞分散均匀。于100×显微镜下观察计数>50个细胞的克隆数。集落形成率(%)=集落数/接种细胞数×100%。集落抑制率(%)=(1-实验组集落形成率/对照组集落形成率)×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 LOXL2-siRNA转染至Hep2细胞对LOXL2表达的影响

与Control组相比，LOXL2-siRNA组细胞LOXL2蛋白表达明显降低(P<0.01)，LOXL2-NC 组和Lipofectamine 2000组细胞LOXL2蛋白表达无显著变化(P>0.05)，见图1。

图1 LOXL2蛋白表达水平

2.2 LOXL2-siRNA对Hep2细胞周期和凋亡的影响

与Control组相比，LOXL2-siRNA组细胞G0/G1期比率以及凋亡指数升高(P<0.01)，S期以及G2/M期细胞降低(P<0.01)，LOXL2-NC 组和Lipofectamine 2000组细胞周期和凋亡指数均无显著变化(P>0.05)，见表1。

表1 各组细胞周期和凋亡指数的比较

2.3 LOXL2-siRNA对Hep2细胞化疗敏感性的影响

平板克隆形成实验结果显示，与DDP处理Control组相比，不同浓度DDP处理LOXL2-siRNA组细胞克隆形成率均显著降低(P<0.05或P<0.01)，DDP处理LOXL2-NC 组和Lipofectamine 2000组细胞克隆形成率无明显变化(P>0.05)，见图2。MTT检测显示在同一DDP药物浓度下，与Control组相比，LOXL2-siRNA组细胞存活率显著降低(P<0.01)，LOXL2-NC 组和Lipofectamine 2000组细胞存活率无明显变化(P>0.05)，见图3。

图2 各组细胞克隆形成率

图3 各组细胞存活率比较

3 讨论

LOXL2是一种分泌性蛋白，与肿瘤细胞的侵袭和转移能力密切相关。在乳腺癌细胞系中LOXL2蛋白呈高表达，且LOXL2表达上调与乳腺癌细胞侵袭和转移能力成正相关[7]。但是目前有关LOXL2对喉癌疾病进展的影响尚不清楚。细胞凋亡是化疗药物诱导肿瘤细胞死亡的主要方式。另外，肿瘤细胞的恶性增殖亦是喉癌细胞恶性病变的关键[8]。因此，通过调控肿瘤细胞增殖和凋亡的平衡是抑制肿瘤恶性病变的关键。基于LOXL2在肿瘤中的作用，本研究推测其可能参与喉癌细胞增殖和凋亡的过程。为此，本实验首先通过基因沉默LOXL2观察Hep2细胞凋亡情况。结果显示与Control组相比，转染LOXL2-siRNA组细胞LOXL2蛋白表达明显降低，细胞凋亡指数明显升高，初步表明LOXL2参与喉癌细胞的凋亡过程，抑制LOXL2表达能够促进细胞凋亡。长期的DDP化疗会诱导肿瘤细胞化疗敏感性降低，其机制涉及多种途径，包括增殖、凋亡、侵袭和迁移等[9]。喉癌细胞化疗敏感性的降低也是制约其治疗的关键。因此，积极探寻喉癌细胞化疗敏感性的发生机制尤为重要。为此，本研究通过设置不同浓度的DDP处理Hep2细胞，观察LOXL2-siRNA对细胞增殖和凋亡的影响。结果显示沉默LOXL2能够抑制Hep2细胞增殖，促进细胞凋亡并增加DDP对肿瘤细胞的化疗敏感性。以上研究表明LOXL2在喉癌细胞增殖、凋亡以及化疗敏感性中发挥重要作用。但是有关LOXL2是通过何种途径影响喉癌细胞凋亡和化疗敏感性尚不清楚。既往研究显示LOXL2能够通过Snail、PI3K/Akt以及上皮间质转化等途径参与肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭和转移过程[10]。为此，本研究后续将探究LOXL2对喉癌细胞凋亡和化疗敏感性的相关作用机制。

综上所述，本实验通过探究LOXL2对人喉鳞癌Hep2细胞凋亡、增殖及化疗敏感性的影响。结果显示沉默LOXL2能够抑制Hep2细胞增殖，促进细胞凋亡以及增加Hep2细胞对顺铂化疗的敏感性。以上研究结果为喉癌的化疗提供了新的作用机制。