张雪 宦大为 刘文月

子宫肌瘤是常见的女性生殖系统良性肿瘤，多见于30～50岁育龄期女性，绝经女性及青少年较少见[1]。子宫肌瘤占全部女性良性肿瘤的半数以上，在妇科常见病中的发病率最高[2]。子宫肌瘤虽然属于良性肿瘤，但其临床症状多样，子宫肌瘤也是常见的子宫切除的重要原因[3]。有研究显示，子宫肌瘤的发生机制复杂，遗传因素、环境等均可能与子宫肌瘤的发生有关[4]。近年来，基因在子宫肌瘤发生和发展中的作用得到广泛重视，通过探讨基因在肿瘤细胞中的作用，人为的干扰或重建肿瘤相关基因可能是子宫肌瘤治疗的途径[5]。miRNA是一类内源性的小分子RNA，其没有开放阅读框，也不具备编码蛋白质功能，其可以通过影响下游信号通路的转导发挥生物学功能[6]。人体内几乎所有细胞中均存在miRNA的表达，这些miRNA不仅参与影响细胞分化、代谢、衰老、凋亡等过程，还影响多种疾病的进展，如关节炎、糖尿病、急性肺损伤等[7]。研究表明，miRNA和肿瘤的关系密切，miRNA在肿瘤的进展中扮演重要角色[8]。既往报道显示，miR-126在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中表达下调，上调miR-126表达能够抑制肿瘤细胞恶性生物学行为[9,10]。在肺癌中发现，miR-126通过抑制P13K/AKT信号降低肿瘤细胞恶性生长能力[11]。P13K/AKT是一个在肿瘤中过度激活的信号通路，其可以诱导肿瘤恶性生长，抑制P13K/AKT减缓肿瘤进程[12]。本实验探讨miR-126对子宫肌瘤细胞增殖、周期和凋亡的作用和机制，为分子靶向治疗子宫肌瘤提供可能思路。

1 材料与方法

1.1 材料 选取我院2017年1月至2018年1月收治的子宫肌瘤患者手术切除的子宫肌瘤组织以及正常子宫肌组织(距离肿瘤组织>3 cm)各51例，p-P13K抗体、p-AKT抗体购自美国Cell Signaling Technology；AKT抗体、C-Caspase-3抗体、cyclin D1抗体购自安诺伦(北京)生物科技有限公司；P13K抗体购自武汉博欧特生物科技有限公司；p21抗体购自美国Abcam；miRNA qRT-PCR试剂盒购自美国GeneCopoeia；mimics control、miR-126 mimics购自美国Thermo。

1.2 qRT-PCR方法检测子宫肌瘤组织中miR-126表达 利用Trizol试剂分别提取子宫肌瘤组织以及正常的子宫肌组织中的RNA，RNA沉淀用DEPC水溶解，长期保存于-80℃冰箱。利用miRNA qRT-PCR试剂盒进行qRT-PCR反应。制备的cDNA合成体系包含以下试剂：3.75 μl的RNA sample、5 μl的mRQ Buffer、1.25 μl的mRQ Enzyme，混合均匀以后放在37℃环境中孵育1 h，然后再置于85℃孵育5 min。把收集到的cDNA放在-20℃条件下保存。配制PCR反应体系，包括：0.5 μl的miRNA-specific Primer、12.5 μl 的SYBR Advantage Premix、0.5 μl的上游以及下游引物、0.5 μl的ROX Dye、2 μl的cDNA，最后以ddH2O补足到25 μl，置于PCR仪上，设置反应程序如下：95℃ 10 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，共进行40个循环。PCR反应的引物序列如下：miR-126上游：ACACTCCAGCTGG

GTCGTACCGTGAGTAAT，下游：TGGTGTCGTGGAGTC

G；内参U6上游：CTCGCTTCGGCAGCACA，下游：AAC

GCTTCACGAATTTGCGT。按照2-△△Ct计算miR-126的表达量。

1.3 子宫肌瘤细胞分离培养 将子宫肌瘤组织剪碎后放在添加有青链霉素的PBS溶液中孵育5 min，然后将PBS溶液弃掉，加入Ⅰ型胶原酶，混合后，置于37℃的水浴锅中消化3 h，添加含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液终止消化，以200目的细胞筛过滤后，4℃，1 000 g离心10 min，收集沉淀，添加新鲜的细胞培养液，放在37℃，5% CO2培养液中培养24 h。期间每隔2 d观察换液1次。子宫肌瘤细胞呈贴壁生长，分离的细胞经α-actin免疫细胞化学法染色鉴定为子宫肌瘤细胞。收集第3代细胞，用于后续实验。

1.4 细胞转染与分组 子宫肌瘤细胞接种到12孔板中，利用转染试剂Lipofectamine 2000分别将mimics control、miR-126 mimics转染到细胞中，命名为miR-NC组、miR-126组，设置未转染的细胞为Control组。细胞转染的详细操作步骤按照转染试剂说明书进行。Control组、miR-NC组、miR-126组细胞培养48 h后，按照1.3中qRT-PCR方法分别检测细胞中miR-126表达变化。

1.5 CCK-8法分析细胞增殖能力变化 子宫肌瘤细胞种植到96孔板内，每个孔加100 μl的细胞悬浮液，含有5 000个细胞，然后按照Control组、miR-NC组、miR-126组分组方法处理培养48 h以后，将培养板取出，吸取10 μl的CCK-8溶液添加到样品孔中，继续放在37℃条件下孵育4 h。以酶标仪测定450 nm的A值，计算细胞存活率变化。细胞存活率=实验组A值/对照组A值×100%

1.6 PI单染法分析细胞周期变化 取培养48 h后的Control组、miR-NC组、miR-126组细胞，将上清溶液弃掉，然后在细胞中加入适量的PBS溶液反复润洗细胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g离心10 min，收集细胞，添加70%乙醇溶液，置于-20℃冰箱中固定24 h。继续添加10 μl、100 mg/ml的RNA酶，混合后，置于37℃环境中结合30 min，然后吸取100 μl的PI染色液添加到细胞中，在室温、避光环境中结合30 min，上流式细胞仪分析并检测周期变化。

1.7 Annexin V-FITC/PI双染法分析细胞凋亡变化 取培养48 h后的Control组、miR-NC组、miR-126组细胞，将上清溶液弃掉，然后在细胞中加入适量的PBS溶液反复润洗细胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g离心10 min，收集细胞，用冰预冷之后的PBS制备成细胞悬浮液(浓度为106个细胞/ml)。用移液枪吸取1 ml的细胞悬浮液，置于离心机中，以900 g离心10 min，把上清溶液弃掉，然后再添加195 μl的结合缓冲液混合，添加5 μl的Annexin V-FITC溶液，置于避光、室温条件下结合15 min，继续添加PI溶液5 μl，放在室温、避光环境中结合15 min。上流式细胞仪检测细胞凋亡变化。

1.8 Western blot方法分析p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达 取培养48 h后的Control组、miR-NC组、miR-126组细胞，将上清溶液弃掉，然后在细胞中加入适量的PBS溶液反复润洗细胞，以0.25%的胰蛋白酶消化，1 000 g离心10 min，收集细胞，添加RIPA溶液，放在冰上充分裂解反应20 min，以4℃，10 000 g离心10 min，吸取上清，按照BCA方法检测蛋白样品的浓度。吸取5×Loading Buffer与蛋白样品按照1∶4的比例混合，置于100℃的水浴煮沸5 min。按照常规方法分别配制分离胶(10%)和浓缩胶(5%)，分别在每个上样孔中添加40 μg的蛋白样品，将电压设置成60 V，肉眼观察染料即将移动至分离胶时，把电压调整到100 V，等到染料运动至玻璃板底部后，关闭电源，停止电泳。把凝胶取出，按照凝胶大小裁剪合适的NC膜，置于4℃条件中转膜，转膜的电流为恒流200 mA。电泳结束以后，将NC膜置于5%牛血清白蛋白中，置于37℃环境中结合1 h，然后把NC膜置于一抗溶液内，于4℃条件下过夜反应，最后将NC膜放在二抗溶液中，置于37℃条件下结合1 h。利用ECL方法显色，以Quantity one分析各个条带的灰度值。内参设置为GAPDH，目的蛋白表达量=目的条带灰度值÷内参灰度值。p-P13K、P13K、p-AKT、AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1抗体稀释倍数分别为1∶800、1∶800、1∶800、1∶800、1∶600、1∶1 000、1∶1 000，二抗稀释倍数为1∶2 000。

1.9 P13K/AKT激活剂IGF-1对miR-126影响子宫肌瘤细胞的作用 取转染miR-126 mimics的子宫肌瘤细胞，用含有P13K/AKT激活剂IGF-1浓度10 ng/ml的细胞培养液刺激细胞，命名为miR-126+IGF-1组，以miR-126组作为参照，按照1.5、1.6、1.7、1.8中方法分别检测细胞增殖、周期、凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达。

2 结果

2.1 miR-126在子宫肌瘤组织中表达下调 子宫肌瘤组织中miR-126表达水平低于正常子宫肌组织(P<0.05)。见表1。

表1 miR-126在子宫肌瘤组织和正常子宫肌组织中的表达变化

2.2 miR-126 mimics上调子宫肌瘤细胞中miR-126表达水平 与Control组、miR-NC组比较，miR-126组子宫肌瘤细胞中miR-126表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 miR-126 mimics转染后子宫肌瘤细胞中miR-126水平

2.3 miR-126对子宫肌瘤细胞增殖、周期和凋亡的影响 与Control组、miR-NC组比较，miR-126组子宫肌瘤细胞存活率降低，细胞凋亡率升高，细胞G0/G1期比例升高，C-Caspase-3和p21蛋白表达增多，cyclin D1蛋白表达减少，差异有统计学意义(P<0.05)。miR-126抑制子宫肌瘤细胞增殖，阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡。见图1,表3。

图1 上调miR-126对子宫肌瘤细胞凋亡和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达影响；A 流式细胞术检测子宫肌瘤细胞凋亡变化；B Western blot检测子宫肌瘤细胞中C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达

表3 上调miR-126后子宫肌瘤细胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白水平比较

2.4 miR-126对子宫肌瘤细胞中P13K/AKT信号通路影响 与Control组、miR-NC组比较，miR-126组子宫肌瘤细胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表达减少(P<0.05)。miR-126抑制子宫肌瘤细胞中P13K/AKT信号通路激活。见图2，表4。

图2 Western blot方法测定miR-126对子宫肌瘤细胞中P13K/AKT信号通路相关蛋白表达影响

表4 上调miR-126后子宫肌瘤细胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水

2.5 P13K/AKT激活剂IGF-1对miR-126影响子宫肌瘤细胞增殖、周期和凋亡的作用 与miR-126组比较，miR-126+IGF-1组子宫肌瘤细胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白表达增多，细胞存活率升高，细胞凋亡率降低，细胞G0/G1期比例降低，细胞中C-Caspase-3、p21蛋白表达减少，cyclin D1蛋白表达增多(P<0.05)。P13K/AKT激活剂IGF-1逆转miR-126对子宫肌瘤细胞增殖、周期和凋亡作用。见图3，表5。

图3 P13K/AKT激活剂IGF-1对上调miR-126的子宫肌瘤细胞凋亡和p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达的影响；A 流式细胞术检测子宫肌瘤细胞凋亡变化；B Western blot检测子宫肌瘤细胞中p-P13K/P13K、p-AKT/AKT、C-Caspase-3、p21、cyclin D1蛋白表达

表5 P13K/AKT激活剂IGF-1处理和上调miR-126后子宫肌瘤细胞存活率、凋亡率、周期分布和C-Caspase-3、p21、cyclin D1、p-P13K/P13K、p-AKT/AKT蛋白水平

3 讨论

miRNA是近年来研究较多的与生命机体正常生理活动有关的调节分子，属于小分子非编码RNA，没有编码蛋白质的功能，对细胞生长、凋亡、分化、能量代谢等均有十分重要的调节作用[13]。很多实验已经证明，miRNA在疾病进展中发挥调控作用，如动脉粥样硬化、关节炎、哮喘等[14]。miRNA和肿瘤的关系已经有很多报道，miRNA在肿瘤中扮演类似抑癌基因或癌基因的作用，通过靶向调控miRNA的表达可能是肿瘤治疗的潜在途径[15]。miR-126定位在9q34.3染色体上，最早发现于乳腺癌组织，miR-126在血管丰富的组织如肺脏、心脏等组织中高表达[16]。有研究显示，miR-126在大部分的肿瘤中表达下调，并且miR-126表水平和肿瘤的进展程度负相关，miR-126在肿瘤的治疗以及诊断中可能具有潜在意义[17]。在胃癌、乳腺癌、胰腺癌等肿瘤中已经证明了miR-126发挥抑制肿瘤进展的作用，其可以抑制肿瘤细胞生长并诱导细胞凋亡[9,18]。本实验表明，miR-126在子宫肌瘤组织中表达下调，并且上调miR-126降低子宫肌瘤细胞生长能力，这也说明miR-126在子宫肌瘤中也可能发挥了抑癌基因的作用。

细胞周期是细胞增殖的基础，细胞增殖和细胞凋亡之间的动态平衡是维持机体稳态的重要方面。细胞周期分成分裂期和分裂间期，其是指从上一次细胞分裂结束到本次细胞分裂结束的整个过程。细胞分裂间期是细胞分裂的准备阶段，受到细胞内多个基因的表达调控作用，细胞分裂间期中有2个重要的调控点，G0/G1向S期进展是其中的1个调控点[19]。cyclin D1是一个细胞周期促进因子，其表达上调后能够诱导细胞进入S期，促进细胞周期进程，进而诱导细胞增殖[20]。p21是细胞周期的抑制因子，其表达水平升高后细胞周期进展被阻滞。细胞凋亡与细胞周期一样，均受到多种因子的调控作用[21]。Caspase-3属于Caspase蛋白家族成员，而Caspase蛋白家族是目前研究的与细胞凋亡关系十分密切的调控子，其蛋白成员被激活后能够形成凋亡级联反应，最终诱导细胞凋亡的发生[22]。Caspase-3位于凋亡级联反应的下游，其只有被活化后形成C-Caspase-3才能诱导细胞凋亡发生。本实验结果显示，miR-126将子宫肌瘤细胞周期阻滞在G0/G1期，同时细胞中cyclin D1蛋白表达水平降低，p21蛋白表达水平升高，这说明miR-126可能通过阻滞细胞周期抑制细胞增殖；miR-126还可以提高子宫肌瘤细胞凋亡率，促进细胞中C-Caspase-3蛋白表达，这提示miR-126诱导子宫肌瘤细胞凋亡。

信号通路在肿瘤进展中发挥十分关键的作用，P13K/AKT信号通路是在肿瘤中异常激活的信号转导通路，下调其激活水平能够抑制肿瘤进展。P13K、AKT是P13K/AKT信号通路的关键蛋白，二者只有被磷酸化以后才可以激活P13K/AKT信号[23]。miRNA发挥作用与调控下游信号有关，其中也包括P13K/AKT信号通路。以前的研究发现，miR-126抑制肺癌、胶质瘤进展与下调P13K/AKT信号通路有关[11,24]。本实验表明，miR-126下调子宫肌瘤细胞中p-P13K、p-AKT蛋白表达水平，抑制P13K/AKT信号激活，而且P13K/AKT信号激活剂还可以逆转miR-126对子宫肌瘤细胞增殖、周期和凋亡的作用，提示miR-126抗子宫肌瘤进展作用与P13K/AKT信号有关。

综上所述，miR-126可能是一个子宫肌瘤抑制因子，其可以在体外通过调控P13K/AKT信号通路抑制子宫肌瘤细胞增殖，阻滞细胞周期和诱导细胞凋亡。