刘廷 姚萍

T细胞共刺激分子B7(B7-H4)属于T细胞共刺激分子B7家族中的一员，能够抑制T细胞增殖和细胞因子产生负性调节T细胞反应[1,2]。有研究表明，其在正常外周组织中无明显阳性表达，在卵巢癌和乳腺癌中具有丰富表达，因此推测，其具有减轻炎症及下调肿瘤应答的作用[3]。microRNA是今年研究中长度约为22核苷酸小分子非编码RNA，其在结肠癌的发生、发展中发挥着重要作用。有研究表明，miR-145、miR-143、miR-34a等在癌细胞中的表达比在正常细胞中明显降低[4]。β-连环素属于胞质内可溶性蛋白是Wnt信号传导中重要的效应物。当Wnt信号传导通路失活时，胞质内高水平β-连环素经泛素-蛋白酶体途径被降解。因此确保β-连环素在体内保持较低的浓度，使细胞进行正常的生理化功能。蒋海涛等[5]研究表明，结直肠组织中β-catenin、COX-2的异位、异常高表达及15-PGDH的表达降低或缺失可能在结直肠癌的发生、发展过程中发挥了关键作用。因此本研究，检测B7-H4、miR-145、β-连环素在结直肠癌组织中的表达，为临床上诊断结直肠癌提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取辽阳市中心医院2019年1月至2020年12月手术后结直肠癌组织标本和癌旁组织标本各48例，结直肠癌组织：男20例，女28例；年龄38～78岁，平均年龄(55.16±22.51)岁；有淋巴结转移25例，无淋巴结转移23例；按照WHO(1999)大肠肿瘤组织学分型标准[6]：高分化19例，中分化17例，低分化12例；根据国际抗癌联盟(UICC)1997年修订的大肠癌Dukes分期标准[7]：Ⅰ期15例，Ⅱ期19例，Ⅲ～Ⅳ期14例；癌旁正常组织组：男23例，女25例；年龄35～80岁，平均年龄(55.68±22.71)岁。2组患者性别比、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准：符合WHO结直肠癌诊断标准[8]；经纤维结肠镜活检并经病理学诊断为结直肠癌，无放化疗史。

1.2.2 排除标准：近期急性感染患者；精神病患者；重大器官损伤患者；自身免疫性疾病患者；排除不愿参与本研究者。

1.3 方法

1.3.1 B7-H4、miR-145、β-连环素检测:使用免疫组化染色对B7-H4、miR-145、β-连环素表达进行检测，将标本切片，HE染色，烤片，梯度乙醇及二甲苯水化，内源性过氧化物酶使用3%H2O2灭活，高压修复使用柠檬酸，封闭20 min在山羊血清中，一抗(B7-H4、miR-145、β-连环素按照1∶100比例稀释)，4℃过夜，二抗(无需稀释)，孵育60 min在37℃环境下，DAB显色，苏木精复染。阴性对照以PBS缓冲液代替一抗。

1.3.2 免疫组化染色处理:将石蜡切片放入二甲苯中进行脱蜡处理10 min，乙醇水化，加入蛋白酶修复液，进行孵化30 min，温度为：37℃，弃抗原；将切片移至与湿盒中，且加入3%H2O2，恒温冰箱孵育10 min，使用PBS冲洗；再次加入山羊血清，常温下封闭30 min，使用滤纸将封闭液吸取，加入一抗，放入湿盒，再次加入二抗，孵育1 h，进行PBS冲洗，经过DAB显色处理10 min，观察棕黄色阳性反应，采用PBS冲洗1 min；使用苏木精染色3 min，使用浓度为1%的盐酸乙醇进行分化处理，使用自来水冲洗1 min，脱水、封片处理。

2 结果

2.1 不同组织B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较 与癌旁正常组织组比较，结直肠癌组B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1，图1、2。

表1 不同组织B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较

B7-H4miR-145 β-连环素

B7-H4miR-145 β-连环素

2.2 有无淋巴结转移B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较 与无淋巴结转移比较，有淋巴结转移B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 有无淋巴结转移B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较

2.3 不同分化情况B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较 与高分化相比，中分化、低分化B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与中分化相比，低分化B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同分化情况B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较

2.4 不同Dukes分期B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较 与Ⅰ期比较，Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期B7-H4、β-连环素表达显著升高，miR-145表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同Dukes分期B7-H4、miR-145、β-连环素表达比较

2.5 B7-H4、miR-145、β-连环素之间相关性分析 B7-H4、miR-145呈负相关(r=-0.481，P=0.001)；miR-145、β-连环素之间呈负相关(r=-0.672，P=0.001)；B7-H4、β-连环素之间呈正相关(r=0.609，P=0.001)。见图3～5。

图3 B7-H4、miR-145之间相关性分析图4 miR-145、β-连环素之间相关性分析图5 B7-H4、β-连环素之间相关性分析

3 讨论

世界范围内，结直肠癌的死亡率居世界第二位，并且逐年上升。虽然放疗、化疗及免疫治疗在一定程度上提高了治疗效果，但对患者的生存期不理想。孟媛等[9]研究表明，结直肠癌组织中EMX2阳性表达减少，EMX2低表达与结直肠癌患者的临床分期、淋巴结转移及预后密切相关，在结直肠癌患者中检测EMX2，可能成为判断患者临床分期和预后指标。因此确定新的分子靶位成为治疗结直肠癌的新疗法。

B7-H4的转录形式可在肺、胰腺、肝、肾等组织中表达，但在蛋白中表达较低。部分肿瘤细胞株和组织中具有B7-H4的表达[10]。B7-H4体外实验发现，细胞相关的非可溶性B7-H4能够抑制T细胞的增殖、细胞因子的分泌及CTL的诱导，其机制是通过抑制细胞周期及细胞的分裂[11]。本研究显示，结直肠癌组B7-H4表达显著升高，说明B7-H4能够作为检测结直肠癌的有效指标。Podojil等[12]研究表明，B7-H4在各种癌症类型的肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞上表达，因此阻断B7-H4的治疗可以有利地改变肿瘤微环境，使抗原特异性清除肿瘤细胞成为可能。本研究表明，有淋巴结转移B7-H4表达显著升高，说明B7-H4与有无淋巴结转移具有相关性。MacGregor等[13]研究表明，B7-H4在肿瘤中的高表达与正常组织中的低表达或缺失蛋白表达相结合，使其成为一个有吸引力的免疫治疗靶点。本研究还发现，与中分化比较，低分化B7-H4表达显著升高，与Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期B7-H4表达显著升高，此结果说明，B7-H4与肿瘤分化程度及肿瘤分期具有相关性。麦泽锋等[14]研究表明，B7-H4在胃癌组织中呈高表达，其与胃癌的临床病理特征存在相关性，对评价胃癌组织中B7-H4的表达对预测胃癌的发生、发展及免疫治疗具有重要意义。

miRNA是一种非转录的内源性分子，定位于5号染色体，具有高保守性的非编码单链小分子RNA[15]。在人类胚胎发育中，表达量较为丰富的组织或器官主要起源于中胚层。目前miR-145初级形式尚未确定，但多数研究认为其和miR-143来源于同一前体[16]。miR-145具有microRNA的共性，能够诱导沉默复合体与mRNA的3’端非翻译区特异性结合，导致靶基因降解或抑制蛋白质翻译，进而调控基因的表达。miR-145是发现与肿瘤关系密切的miRNA之一[17,18]。本研究显示，结直肠癌组miR-145表达显著降低，表明miR-145能够作为检测结直肠癌的有效指标之一。叶伟标等[19]研究表明，miR-145低表达与结直肠癌侵袭和转移相关，其机制可能与调控Catenin-δ1的表达水平相关。本研究还显示，有淋巴结转移miR-145表达显著降低，表明miR-145与有无淋巴结转移具有相关性。邱厚兵等[20]研究表明，血清低miR-145、低miR-29和低miR-217水平对膀胱癌的诊断以及在评估膀胱癌患者发生肿瘤远处转移中均具有重要临床意义。本研究还发现，与中分化比较，低分化miR-145表达显著降低，与Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期miR-145表达显著降低，说明miR-145与疾病的分化程度及分期具有相关性。袁俊建等[21]研究表明，肝癌患者血清miR-143、miR-145表达水平升高,其高表达对肝癌患者预后有明显影响，可作为肝癌预后的评估指标。

β-连环素(β-catenin)被认为是一种细胞粘附分子，后来发现其属于Wnt通路的效应物[22]。β-catenin在细胞中主要以两种形式存在，分别为：结合型、游离型。结合型主要参与调解两种细胞间的粘附；游离型参与Wnt信号传导突进，游离的β-catenin通过核膜进入细胞核内，与DNA亲合蛋白LEF/TCF相结合，激活Wnt途径靶基因，调解细胞增殖，参与肿瘤的形成[23]。本研究显示，结直肠癌组β-连环素表达显著升高，说明β-连环素与肿瘤的发生、发展具有重要作用。宋晨等[24]研究表明，EN2及β-catenin在卵巢癌组织中高表达，可能与卵巢癌的发生、发展相关。本研究表明，有淋巴结转移β-连环素表达显著升高，说明β-连环素与有无淋巴结转移具有一定的相关性。王林辉等[25]研究表明，ILK、β-catenin和VEGF在NSCLC中高表达且相互影响，对其浸润深度、淋巴结转移和远处器官转移等都有着重要作用。本研究还发现，与中分化相比，低分化β-连环素表达显著升高，与Ⅱ期比较，Ⅲ～Ⅳ期β-连环素表达显著升高，说明β-连环素与肿瘤的分化程度及分期具有重要意义。刘甜甜等[26]也认同此结果。

综上所述，B7-H4、β-连环素在结肠癌组织中高表达，miR-145低表达，与癌细胞的分化程度、分期密切相关，三项联合检测可成为检测结直肠癌的有效指标。