潘亚菲，赵志军，党甜甜，陈 梅，马 苗，贾 伟

（1.宁夏医科大学临床医学院，银川 750004；2.宁夏医科大学总医院医学实验中心，银川 750004；3.宁夏病原微生物重点实验室，银川 750004）

肺炎克雷伯菌（Klebsiella.peneumoniae，Kpn）作为临床常见的条件致病菌，在宿主免疫力低下或伴发基础疾病时可以引起呼吸道、消化道和泌尿生殖道等感染，分布广泛。现今，Kpn的耐药问题变得愈加严峻[1]，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（Carbapenem-resistant klebsiella pneumoniae，CRKP）因传播效率高、难以治愈且致死率高等特点受到广泛关注。根据我国最新耐药监测结果报道[2]，Kpn对碳青霉烯类药物的耐药率已超过20%。由细菌合成和分泌的一种低分子量分子称为铁载体，它可以通过周围环境螯合铁，促进细菌对铁的吸收，进而参与细菌代谢与生长[3]。研究[4]发现，铁载体可作为受体将抗生素分子转入细菌内，从而影响细菌的耐药性。据报道[5]，Kpn对喹诺酮类、头孢类耐药程度与铁载体产量相关。探究Kpn铁载体与碳青霉烯类药物耐药性的研究仍较少[6]。因此，本研究通过对Kpn产铁载体能力分析、常见耐药基因和铁载体基因的检测以及CRKP菌株产酶型的鉴定等，探讨目前CRKP菌株的流行情况，并分析碳青霉烯类抗生素耐药性与Kpn产铁载体能力的关系，以期为临床解决抗生素耐药问题提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验菌株

本研究所使用的60株Kpn均来自2019年宁夏医科大学总医院临床收集，全部菌株分离纯化。使用的所有菌株都通过了VITEK2Compact全自动微生物分析系统的鉴定。标准菌株为肺炎克雷伯菌ATCC BAA-1705、ATCC BAA-1706和大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 铬天青S（CAS）平板检测

将CAS平板四分区，分别加入10 μL菌液在CAS检测板上，待菌液干燥后放入培养箱，37℃培养18～24 h。若经过培养后的菌落周围呈现橘黄色分泌环，表明有铁载体的产生。

1.3 嗜铁素相对含量测定

制备菌悬液，紫外分光光度法检测得到铁载体的相对含量。将临床分离的60株Kpn以10 000 r·min-1速度离心10 min，再取上清3 mL与CAS检测液等体积混合，在黑暗中放置30 min，以双蒸水为对照，将630 nm处的吸光度（As）调整为零。将空白介质与等量的CAS检测液混合，以其吸光度（Ar）值为参比，按公式［（Ar-As）/Ar］×100%计算，得到不同的铁载体含量。根据铁载体总含量的中位数，将菌株分为高产铁载体组和低产铁载体组，每组细菌均为30株。实验重复3次。

1.4 基因扩增

通过煮沸法提取细菌DNA，PCR检测相应的铁载体基因和碳青霉烯类耐药基因。本研究中所使用引物由上海生工生物工程有限公司合成，其扩增体系为20 μL，在这其中包括2×Taq DNA Mix酶10 μL，模板1 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为：94℃下5 min，94℃下60 s，退火60 s（见表1），72℃下60 s，循环32次，72℃下10 min。用10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳观察产物。

表1 PCR引物序列

1.5 药敏实验

根据CLSI 2018年M100-S28文件检测步骤，将美罗培南药敏纸片浸没于菌悬液中，以浸于无菌水中的美罗培南药敏纸片作为空白对照。以KpnATCC BAA-1705菌液中的美罗培南药敏纸片作为丝氨酸碳青霉烯酶阳性对照，KpnATCC BAA-1706作为碳青霉烯酶阴性对照。测量抑菌圈大小，进行结果判读。

1.6 统计学方法

数据使用SPSS 22.0统计软件进行分析。60株Kpn铁载体含量呈偏态分布，根据中位数进行分组，两组Kpn铁载体含量分别呈正态分布，组间比较采用双样本独立t检验；高产铁载体组与低产铁载体组对碳青霉烯类抗生素耐药性的差异、耐药基因和铁载体基因阳性率差异比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Kpn铁载体产量结果

铁载体含量测定表明，60株Kpn均产生橘黄色分泌环，说明都产生铁载体，且由于分泌环的直径不同，各菌株产生的铁载体数量也不同。用酶标仪定量检测细菌铁载体含量，获得60株Kpn铁载体含量范围为（-41.1±0.1）%～（45.8±0.2）%。铁载体总含量的中位数为21.69%，将60株Kpn分为高产铁载体组（铁载体含量＞21.69%）和低产铁载体组（铁载体含量＜21.69%），见表2。低产铁载体组的铁载体产量低于高产铁载体组（t=9.530，P＜0.01），见图1。

表2 60株Kpn铁载体产量结果（%）

图1 肺炎克雷伯菌铁载体产量比较

2.2 铁载体基因与耐药基因筛选结果

Kpn铁载体基因型检测结果见图2，60株Kpn中，铁载体基因检出情况为:ent B85.0%（51/60）、iron B11.7%（7/60）、ybt S28.3%（17/60）。

图2 Kpn铁载体基因型检测结果

60株Kpn中CRKP的检出率为50.0%，有3株未检出耐药基因，27株碳青霉烯类耐药基因阳性。其中携带B类碳青霉烯酶基因（blaNDM）16株、B类碳青霉烯酶基因（blaIMP）9株、A类碳青霉烯酶基因（blaKPC）10株、D类碳青霉烯酶基因（blaOXA-48）15株，阳性率分别为26.7%、15.0%、16.7%和25.0%。27株CRKP中，10株仅携带blaKPC，2株仅携带blaNDM，1株同时携带blaIMP和blaOXA-48菌 株，6株 同 时 携 带blaNDM和blaOXA-48菌 株，8株 同 时 携 带blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株。

2.3 表型结果

10株blaKPC阳性菌株中，改良碳青霉烯类失活法（mCIM）阳性9株、阴性1株；EDTA-碳青霉烯类失活法（eCIM）阳性1株、阴性8株、无效结果1株；2株blaNDM阳性菌株中，mCIM和eCIM均为阳性；1株同时携带blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均为阳性；6株同时携带blaNDM和blaOXA-48菌株，mCIM和eCIM均为阳性；8株同时携带blaNDM、blaIMP和blaOXA-48菌株，mCIM阳性7株、阴性1株，eCIM阳性7株、无效结果1株，部分表型结果见表3。

表3 部分表型结果

2.4 表型试验结果评价

以PCR结果为金标准，mCIM试验的敏感度与特异度均＞90%。mCIM试验与PCR结果一致性较好（Kappa=0.832），见表4。

表4 表型试验结果

2.5 两组铁载体产量与铁载体基因、耐药基因阳性率的比较

高产铁载体组铁载体相关基因ent B和ybt S阳性率均高于低产铁载体组，耐药基因NDM阳性率低于低产铁载体组（P均＜0.05）。其余铁载体相关基因和耐药基因两组间差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表5。

表5 两组耐药基因、铁载体基因阳性率比较

2.6 产铁载体能力与碳青霉烯类耐药的关系

高产铁载体组碳青霉烯类耐药率（30%）低于低产铁载体组（70%）（χ2=9.600，P＜0.01）。根据药敏实验结果，将60株Kpn分为碳青霉烯类药物敏感组（30株）与耐药组（30株），碳青霉烯类药物耐药组铁载体产量低于敏感组（t=2.481，P＜0.05），见图3。

图3 碳青霉烯类耐药组和敏感组铁载体产量比较

3 讨论

碳青霉烯类抗生素是临床目前用于治疗肠杆菌科细菌感染最为有效的抗生素，特别是针对产超广谱β-内酰胺酶和AmpC酶的多重耐药菌[7]。随着该类药物在临床上的应用越来越广泛，导致肠杆菌科细菌对其敏感性降低甚至耐药。其中多数CRKP对几乎所有的β-内酰胺类抗生素耐药，这对于临床抗感染治疗造成了极大的挑战[8]。本研究收集的宁夏地区2019年临床分离的60株Kpn菌株中，通过PCR检测出有27株菌株为碳青霉烯类耐药基因阳性，达到了45%，且CRKP菌株的碳青霉烯酶基因以NDM为主，检出率为30%。该结果与我国大部分地区以KPC基因型流行为主不同[9-10]，可能由于地区上的差异，不同耐药基因的分布也有所不同，因此应依据当地耐药菌的耐药特点来进行抗生素的选择。在临床抗感染治疗和防治上，鉴定CRKP产酶菌株具有重要意义。本项研究中，mCIM试验的敏感度为92.59%，特异度为90.90%，与PCR结果一致性较好。根据美国临床和实验室标准化协会（CLSI）建议，通过eCIM实验初步分类了碳青霉烯酶的型别[11]。该结果显示eCIM灵敏度较高，考虑到eCIM试验具有一定的局限性，只能应用于单产金属酶的检测，如果同时携带其他类型的碳青霉烯酶的菌株进行检测时，则可能出现假阴性结果[12]，因此还应该参考相关耐药基因的检测结果。

铁是大多数生物体极其重要的生命元素，在细菌的生化代谢反应、电子传递和其他生命活动中不可或缺[13]。在缺铁条件下，微生物会分泌一种低分子量的铁螯合剂，称为铁载体。铁载体则与细菌耐药性有着密切联系。部分革兰阴性菌耐药原因为抗生素分子较大，无法进入细菌[14]。而铁载体－抗生素结合形成的轭合物可以转入细菌内，从而抑制细菌的生长[4]。本研究显示肺炎克雷伯菌铁载体的产量与碳青霉烯类抗生素耐药性有关，高产铁载体组耐药率低于低产铁载体组，且碳青霉烯类耐药组产铁能力低于敏感组。表明肺炎克雷伯菌碳青霉烯类抗生素的耐药性与其产铁载体能力可能存在着一定关联性，考虑原因为：铁载体含量较高，细菌更易与抗生素形成轭合物，从而使抗生素进入细菌内杀灭病原菌。近年来，新型铁载体药物利用细菌自身的铁吸收系统进入细菌，使其铁载体含量增加。该类药物具有独特的穿透革兰阴性菌细胞膜的作用机制，从而克服碳青霉烯耐药[15]。Bachman等[16]研究发现，从呼吸道分离的Kpn对β-内酰胺类抗生素敏感，ent B和ybt S阳性率较低。可能由于只检测了一些铁载体基因的携带情况，并未直接分析细菌产生铁载体的能力，从而导致结果出现偏差。

本研究通过对Kpn耐药基因进行筛选，汇总和分析了CRKP的分子流行情况，通过方法学对mCIM实验进行了评价，发现Kpn铁载体的产量与碳青霉烯类抗生素耐药性有关。在今后的研究中，将对抗生素耐药性与其产铁载体的相关机制进行深入探究，针对目前临床的细菌耐药问题提供更加完善的理论依据。