赵阳安， 芦光新*， 邓 晔， 王英成， 马 坤， 颜珲璘， 张海娟， 周学丽， 窦声云

(1. 青海大学农牧学院， 青海 西宁 810016；2. 中国科学院生态环境研究中心, 北京 100080；3. 青海省草原改良试验站， 青海 共和 813000)

紫花苜蓿(Medicagosativa)作为“牧草之王”，具有适应性广、营养价值高、适口性好等优良特点[1],在我国种植面积逾400万hm2[2]，是我国畜牧业发展不可缺少的饲料作物之一。在高寒地区栽培过程中，由于地区环境及春化作用，导致紫花苜蓿种植地大寒大旱，苜蓿越冬率低，品质与适应性表现良莠不齐[3]，严重影响着高寒地区苜蓿种植的品质与产量。

针对高寒地区种植苜蓿不抗寒、越冬率低的状况，开展苜蓿在高寒地区的适应性研究，成为了高寒地区的研究热点。近年来，相关学者从植株各个角度对苜蓿在高寒地区的适应性进行研究，其中固氮根瘤共生体研究最多，而对于生物肥料的研究相对较少，生物肥料作为一类含有大量微生物的特殊肥料，在施入土壤中时，大量微生物在适宜条件下能够积极活动，有的可在作物根的周围大量繁殖，发挥自生固氮或联合固氮作用[4]，有的还可分解磷、钾矿质元素供给作物吸收或分泌生长激素刺激作物生长[5]。根瘤菌肥料作为生物肥料中豆科植物专用肥，施入土壤可以诱导豆科植物形成根瘤，不仅能大量形成共生固氮类菌体，还能分泌植物生长激素，促进植物生长[6-7]。大量研究证实，施用根瘤菌菌剂可增加紫花苜蓿的结瘤数，固定游离氮，提高紫花苜蓿的结瘤固氮效率，培肥地力、改善土壤团粒结构以及牧草品质[8-9]。相关研究[10-11]发现，紫花苜蓿接种根瘤菌可有效促进结瘤，提高紫花苜蓿的产量和品质。Agnello等[12]的研究发现种植苜蓿能够有效提高根际细菌活性。耿德洲等[13]采用高通量测序技术发现，与农田相比，贫营养型细菌类群酸杆菌门丰度在苜蓿土壤中有所增加，而富营养型细菌类群变形菌门则减少。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分，其群落结构的多样性可以反映出生态环境的功能演变及其环境影响[9，14]。由于根系的穿插，使根际的通气条件和水分状况优于根际外，从而形成利于微生物的生态环境。以上研究均表明施肥、接种会对苜蓿产量、品质以及土壤微生物造成一定影响。

因此，本研究于环青海湖地区的青海省草原改良试验站进行实验小区田间试验，利用田间观测和高通量测序技术方法对两种苜蓿生长状况和土壤根际微生物进行研究，分析在不同拌种根瘤菌条件下环青海湖地区两种苜蓿生长及根际土壤微生物的变化规律，探讨两种苜蓿生长及根际微生物多样性与拌种根瘤菌剂量间的相互关系，旨在明确微生物肥料对土壤生态环境的影响，为苜蓿改良土壤和草牧业的可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于青海湖西岸的青海省草原改良试验站，即共和县石乃亥乡境内，属三州三县三乡(镇)地域交界之地，距青海湖约11 km，位于东径99°35′，北纬37°05′，平均海拔3 270 m。该地区气温低、昼夜温差大、降雨少而集中、日照长、太阳辐射强[15-16]，年平均气温-0.7℃，年降水量368.11 mm，年蒸发量1 495.3 mm，相对湿度58%。

1.2 试验设计与样品采集

1.2.1试验设计 试验采用随机区组排列，在青海省草原改良试验站布置3 m×5 m实验小区，小区间距1 m。按0.067 ha 0 g，25 g，50 g，75 g根瘤菌菌肥剂量设计0，25%，50%，75% 4个拌种浓度梯度，3次重复，共设24个小区。

苜蓿品种选用北京林业大学的‘北林201’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Beilin201’)和‘北林202’紫花苜蓿(Medicagosativa‘Beilin202’)。拌种所用根瘤菌剂选自四川省川草生态科技开发有限责任公司提供的25 kg·袋-1规模的固氮根瘤菌剂。于2020年6月15日按2 000 g·(0.067 ha)-1种子播种，播种前将根瘤菌剂与苜蓿种子按0 g·(0.067 ha)-1,25 g·(0.067 ha)-1,50 g·(0.067 ha)-1,75 g·(0.067 ha)-1的比例充分混合，使每个种子表面都均匀黏上菌液，在阴凉处晾干，12小时内播种，播种时每隔20 cm开沟5 cm深，将拌种均匀的撒入沟中，覆盖并踩实。

1.2.2样品采集 于2020年9月11日，对各小区植被生长状况进行观测并对长势均匀区域进行随机取样，利用铁铲大范围的铲出完整苜蓿根，抖落根系大块土壤板结，收集附于根上0～5 mm的土壤作为根际土[17]，立即装入无菌密封袋，低温运回实验室，于-80℃冰箱保存，用于微生物分析。

1.3 测定指标及方法

1.3.1苜蓿生长速率测定 从7月19日开始，每10 d随机选取10株测量株高并取均值(测5次)，相隔两次的值来计算其相对生长速率。

其中P为测量的株高，而n是相隔10 d后的测量次数。通常株高指自然高度，最后换算为cm。

1.3.2生物量的测定 在苜蓿生长期每隔10 d在每个小区内密度、长势均匀的地方，随机选择十株，采用刈割法，齐地面剪取植物地上部分，装在信封袋中带回实验室，105℃杀青2 h，在65℃下于鼓风干燥箱烘至质量恒定，测定干重，作为地上生物量的指标。

1.3.3土壤微生物的测定 将保存于-80℃的土壤样品，根据MOBIO土壤强力DNA提取试剂盒(MOBIO Laboratories,Carlsbad,CA,美国)说明书从0.25 g土壤中提取总DNA，16S rRNA用V3-V4区的通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWT-CTAAT-3′)扩增，基于Illumina Miseq测序平台进行高通量测序。测序委托深圳美格基因公司进行测序。

1.4 数据处理与统计检验

利用Galaxy分析平台(http://mem.rcees.ac.cn:8080/)整理微生物测序的原始数据[18-19]。使用UPARSE[20]将序列聚类为可操作的分类单元(OTU)，序列相似度阈值为97%，获得OTU表进行后续的微生物多样性分析。韦恩图应用Draw Venn绘制平台(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)进行制作，其他图均利用Origin 2019制作。

2 结果与分析

2.1 两种苜蓿株高和生长速率差异分析

对不同拌种浓度梯度下两种苜蓿株高分析发现(图1)，两种苜蓿株高随着拌种浓度的增加呈现先上升后下降趋势，即在拌种浓度梯度达到50%后，两种苜蓿株高发生降低趋势；‘北林201’苜蓿株高达到了12.47 cm，‘北林202’苜蓿则为13.43 cm；拌种对‘北林202’苜蓿的作用高于‘北林201’苜蓿。

图1 两种苜蓿株高Fig.1 Two kinds of alfalfa plant heights注：A代表‘北林201’，B代表‘北林202’；1，2，3，4分别代表拌拌种梯度0，25%，50%和75%；不同小写字母表示各处理间的显著差异性(P<0.05)。下同Note:A stands for ‘Beilin 201’,and B stands for ‘Beilin 202’;1,2,3 and 4 represent the fertilizer gradient 0,25%,50% and 75%,respectively;Different lowercase letters indicate significant differences between treatments at the 0.05 level. The same as below

两种苜蓿生长速率绘制的生长曲线如图2所示，在四个拌种浓度梯度下‘北林201’苜蓿的生长速率分别是0.237，0.225，0.255，0.238；‘北林202’苜蓿的生长速率分别是0.258，0.268，0.273和0.243。在拌种梯度为50%的条件下，‘北林201’苜蓿和‘北林202’苜蓿生长率均为最高,并且‘北林202’苜蓿生长速率比‘北林201’苜蓿生长速率增加了1.8%。

图2 两种苜蓿梯度生长曲线分析Fig.2 Tow kinds of alfalfa gradient growth curve注：RGR代表生长速率，简写为RNote:RGR stands for growth rate,abbreviated as R

2.2 两种苜蓿地上生物量分析

通过对两种苜蓿地上生物量差异分析，发现对于‘北林201’，不拌种处理的苜蓿生物量显著高于拌种处理(P<0.05)，并且随着拌种剂量的增加，‘北林201’的生物量呈降低趋势。而对于‘北林202’苜蓿，25%的拌种浓度增加了苜蓿的生物量，但是当拌种浓度为50%和75%时，苜蓿的生物量并没有增加(图3)，‘北林202’苜蓿生物量表现出先增加后降低的趋势，但是差异性不显著。

图3 不同拌拌种剂量下的两种苜蓿地上生物量图Fig.3 Yield of two kinds of alfalfa under different dosages of bacterial fertilizer

2.3 两种苜蓿根际群落分析

2.3.1两种苜蓿根际细菌群落多样性分析 48个土壤样本共获得620多万条高质量细菌16S rRNA基因序列，由于各样本序列差异较大，将所有的样本统一到相同的总Reads数量(34 541)对每个样本进行随机重抽，对样本不同处理之间的OTU进行比较，利用韦恩图说明两种苜蓿在不同拌种处理下独有和共有的OTU数，并将其可视化(图4)。其中，对于‘北林201’苜蓿，四个拌种浓度梯度处理共有的OTU有18个，而不拌种处理的OTU数明显高于拌种处理，高出242个OTU，四个拌种浓度梯度独有的OTU分别有1 332，1 115，1 018，1 140个。对于‘北林202’苜蓿，四个拌种梯度共有的OTU数是8个，与‘北林201’不同的是，‘北林202’在75%浓度梯度下独有的OTU数最多，为1 258个(图4)。

图4 两种苜蓿根际土壤韦恩图Fig.4 Venn diagram of two alfalfa rhizosphere soils

应用辛普森指数(Inv_Simpson)、丰富度指数(Observed_richness)来表征苜蓿土壤细菌的α多样性。由图5-A可知，拌种处理后有增加‘北林201’苜蓿的辛普森指数(Inv_Simpson)趋势，但差异不显著，且在拌种剂量为50%时出现最高；而丰富度指数(Observed_richness)则是随着拌种梯度的增加逐渐下降。表明拌种处理增加了‘北林201’紫花苜蓿根际土壤的物种多样性却减少了物种丰富度。

图5 两种苜蓿样品土壤α多样性Fig.5 Two kinds of alfalfa Sample soil alpha diversity注：Inv_Simpson表示辛普森指数，Observed_richness表示丰富度指数Note:Inv_Simpson represents the Simpson index,and Observed_richness represents the richness index

对于‘北林202’苜蓿，其辛普森指数(Inv_Simpson)、丰富度指数(Observed_richness)均在拌种25%梯度时下降，在拌种50%上升，之后在75%梯度时再次下降，表现出先下降再上升后降低的趋势；但是在拌种50%情况下，其辛普森指数(Inv_Simpson)明显高于不拌种处理而丰富度指数(Observed_richness)低于不拌种处理(P<0.05)。同样说明拌种处理增加了‘北林202’紫花苜蓿根际土壤的物种多样性却减少了物种丰富度。

2.3.2两种苜蓿根际细菌群落组成分析 本研究两种苜蓿所有的样本共检测到44门784属，在门水平上，两种苜蓿的优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)。对于‘北林201’，拌种处理增加了变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)的相对丰度，分别增加了6.82%，15.93%，31.55%，降低了放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度，分别降低了31.79%，18.67%。‘北林202’苜蓿拌种处理与不拌种处理相比，拌种增加了9.16%的放线菌门(Actinobacteria)和10.72%的厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度。

在属水平上，两种苜蓿的优势菌属均为节杆菌(Arthrobacter)、微小杆菌(Exiguobacterium)、假单胞菌(Pseudomonas)、黄杆菌(Flavobacterium)、肠杆菌(Enterobacter)、不动杆菌(Acinetobacter)、根瘤菌(Rhizobium)。对于‘北林201’，拌种处理增加了微小杆菌(Exiguobacterium)、不动杆菌(Acinetobacter)、根瘤菌(Rhizobium)的相对丰度，分别增加了2.05%，2.53%，0.80%，降低了节杆菌(Arthrobacter)、肠杆菌(Enterobacter)的相对丰度，分别降低了4.43%和2.54%。‘北林202’苜蓿拌种处理与不拌种处理相比，拌种增加了1.94%的节杆菌(Arthrobacter)、2.26%的微小杆菌(Exiguobacterium)和1.72%的假单胞菌(Pseudomonas)的相对丰度。

图6 ‘北林201’苜蓿门、属分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.6 The relative abundance of bacterial communities in ‘Beilin 201’ Medicago phylum and genus classification level

图7 ‘北林202’苜蓿门、属分类水平下的细菌群落相对丰度Fig.7 The relative abundance of bacterial communities in ‘Beilin 202’ Medicago phylum and genus classification level

2.3.3两种苜蓿根际细菌群落结构分析 基于Bray-Curtis距离(表1)进行的非度量多维尺度法NMDS群落结构分析表明，‘北林201’苜蓿根际微生物在细菌水平上群落分布比较集中(图8左)。‘北林202’苜蓿的NMDS分析如图8右所示，拌种处理的群落相似性逐渐降低；相对于不拌种处理，拌种处理的群落分布越来越集中，表明拌种处理影响了土壤微生物群落结构。

图8 两种苜蓿根际细菌NMDS分析Fig.8 NMDS analysis of two alfalfa rhizosphere bacteria

表1 两种苜蓿根际细菌不相似性检验Table 1 Two kinds of alfalfa rhizosphere bacteria dissimilarity test

3 讨论

3.1 拌种对两种苜蓿株高和生物量的影响

生物菌肥作为一种新型的环境友好型肥料，其所包含的有益微生物不仅能给植物提供营养物质，促进植物生长，起到使植物增产的作用，同时也能很好的改善土壤质量[21]。本研究结果表明，生物拌种处理的两种苜蓿株高和生长速率都明显增加，且在拌种浓度为50%时增长最明显，该结果与前人研究[10，22-23]的结果一致，添加生物菌肥能明显增加植被的株高。卢秉林等[24]通过田间试验，结果发现添加生物菌肥能增加春小麦生物产量和穗长。陈龙等[25]研究微生物肥替代化肥时发现，微生物肥能显著增加玉米的株高、地上生物量、穗重。李敏等[26]研究发现生物菌肥可促进黄瓜株高、茎粗和叶片数。本研究结果表明拌种处理后‘北林202’生物量先增加后降低，但是‘北林201’生物量减少，这可能与牧草种植时间太晚导致牧草错过最佳生长期有关。除此之外，影响苜蓿生长状况的因素还有苜蓿品种、施肥量、种植株距和行距、刈割高度、气候、日光照等，亦有可能是生物肥料的时空局限性，对两种苜蓿的响应不同，牧草尚未适应当地环境和肥料条件，进而导致生物量增加不明显，具体原因还需进一步研究。

3.2 拌种处理对两种苜蓿土壤微生物的影响

土壤细菌群落多样性受种植作物的影响[27]，不同的微生物通过分泌不同胞外酶从而在土壤养分循环中发挥着不同的功能[28]，进而使作物生长，即土壤微生物群落多样性影响种植作物的生物量，有研究表明：某些微生物会与植被形成共生体系，如固氮菌与豆科植物形成根瘤菌，促进豆科植物的生长和产量提高[29-31]。本研究结果表明拌种处理后两种苜蓿多样性增加，丰富度降低，这与拌种处理后‘北林202’生物量先增加后降低，‘北林201’生物量减少对应，说明拌种对‘北林201’和202产量的差异性与土壤微生物差异性是有关系的。对于两种苜蓿细菌群落组成分析表明，两种苜蓿的主要优势菌门均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)，且拌种处理增加了变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度，这两个门水平下的许多微生物能很好的适应并生存于各类环境，甚至是极端环境[32-33]；变形菌门(Proteobacteria)包括植物共生的细菌(如根瘤菌属)，因此说明拌种处理增强了两种苜蓿固氮的可能性。本研究结果表明，拌种处理后土壤细菌群落结构存在差异，说明拌种处理对于微生物群落结构有一定的影响。相关研究[34-35]发现，增施生物菌肥能增加土壤细菌数量，改善土壤理化性质，调节土壤微生物生态,有效解除作物连作障碍；孙家骏和陈龙等[25，36]发现，施用生物有机肥可提高土壤酶活性以及微生物物种多样性，增加土壤细菌和放线菌数量，这一结果与本研究结果一致，拌种处理后‘北林202’苜蓿的根际微生物细菌数量增加，且放线菌门和变形菌门的相对丰度增加。

4 结论

本研究利用田间观测和高通量技术对两种苜蓿拌种处理后生长状况及土壤细菌群落多样性的分析结果表明：拌种处理之后，两种苜蓿的株高、生长率皆有明显增加，且在拌种浓度为50%时效果最佳；拌种处理影响了两种苜蓿土壤细菌多样性和群落组成，其中，拌种处理增加了‘北林202’土壤细菌多样性，但降低了‘北林201’的细菌多样性，并且拌种处理增加了变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)的相对丰度。该研究探讨了豆科牧草在拌种处理后对两种苜蓿生长及根际微生物的影响，为微生物/植被生态修复技术中豆科共生体优势产生的机理提供科学依据。同时，本研究为退化草地土壤微生物修复提供依据。