刘达 塞娜 秦含黛 王建泽 孙健斌 张桐 郭维维 于宁 韩维举

解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科医学部；国家耳鼻咽喉疾病临床医学研究中心（北京 100853）

据世界卫生组织估计，全球约有15亿人患有某种程度的听力损失，其中约4.3亿人需要针对听力损失的康复服务[1]。噪声性耳聋是平、战时造成听力损伤的主要原因，不仅影响个人心身健康,也为社会带来沉重负担[2,3]。噪声可以引起内耳炎症[4]，NLR家族含吡咯结构域3（NLRP3）表达增加，并通过激活下游的半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)及炎症相关因子IL-1β、IL-6介导了内耳的损伤[5,6]。氢气具有显著的抗炎作用，但其防治噪声性耳聋的机制尚不完全清楚。本研究为探索氢气干预是否可以通过抑制噪声后内耳NLRP3的表达从而保护听力。

1 材料和方法

1.1 实验动物分组

6周龄雄性C57BL/6小鼠购于北京斯贝福生物有限公司。使用随机数法分为对照组、噪声组及噪声+氢气组各10只。噪声组给予120dB SPL白噪声4小时，将小鼠固定在金属笼中限制活动，噪声开始和结束时使用听级计测量每个金属笼噪声强度为120±1dB。噪声+氢气组给予吸入氢气2h后，给予相同条件噪声暴露，次日继续每日吸入氢气2小时，共7天。氢气由Healthgen AMS-H-01制氢机产生后通过管道输入临时饲养箱，气体检测仪测定箱内氢气浓度稳定在大于1000 ppm。对照组不给予噪声及氢气处理。听性脑干阈值反应（auditory brainstem response,ABR）测试使用美国TDTⅢ测听设备和Biosig软件系统进行测试，方法如文献所述[6]。本实验通过解放军总医院实验动物福利伦理审查。

1.2 取材及免疫荧光

表面制备法耳蜗铺片，用于本实验的一抗有：兔抗 NLRP3多克隆抗体（abcam,ab214185）,兔抗caspase-1多克隆抗体（abcam,ab1872），二抗有Al‐exa Fluor 488羊抗兔IgG抗体，Alexa Fluor 568羊抗兔IgG抗体。充分漂洗后用含DAPI甘油封片。使用蔡司共聚焦显微镜选择405nm（蓝色）、488nm（绿色）及555nm（红色）波长的激发光对标本进行观察，以0.26μm厚度层扫标本，使用ZEN（blue 2.3 Sp）软件将图片通过正交投影叠加处理。

1.3 蛋白质免疫印迹（Western Blot）

Western Blot法定量分析各组小鼠耳蜗NLRP3及caspase-1表达。分别在噪声后1天，7天处死动物，提取整个耳蜗蛋白质,聚丙烯酸胺凝胶电泳、转膜、5%脱脂奶粉封闭,加入抗NLRP3（abcam，ab4207）、抗caspase-1（abcam，ab1872，1:2000）及抗β-actin（immunoway，YM3028）一抗，4℃孵育过夜,次日加入相应二抗在室温孵育1小时，通过凝胶成像系统成像。使用Image J图像分析软件测量条带的灰度值，以目的蛋白与内参蛋白灰度比值作为相对含量进行统计分析。

1.4 小鼠耳蜗淋巴液提取及炎症因子检测

噪声后7天处死小鼠并取出耳蜗，显微镊在耳蜗蜗顶破孔，移液枪抽出淋巴液。每组提取5只小鼠耳蜗淋巴液（共10耳），离心后取10μl上清液，稀释5倍后进行检测。ELISA法检测稀释液中的IL-1β、IL-6及IL-10浓度，根据标准品吸光度绘制标准曲线，得出回归方程并计算炎症因子浓度值,将浓度值乘以稀释倍数得出其在淋巴液中的实际浓度。

1.5 统计学处理

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，数据以平均数±标准差（±s）表示，组间使用成组t检验进行比较，以P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 噪声暴露及氢气干预对耳蜗炎症复合体表达的影响

噪声后7天取材,使用鬼笔环肽（phalloidin）与抗NLRP3一抗共染色（图1a），对照组NLRP3在耳蜗毛细胞中少量表达，噪声组毛细胞NLRP3荧光强度增强，以内毛细胞更为明显。噪声+氢气组NLRP3荧光强度弱于噪声组。分别在噪声后1天、7天取各组耳蜗进行Western Blot实验，对照组耳蜗内NLRP3少量表达，噪声组和噪声+氢气组在噪声后1天表达均显著增加（P<0.05），但此时噪声组与噪声+氢气组间无显著差异。噪声后第7天噪声+氢气组比噪声组显著降低（P<0.05）（图1b，c）。

图1 各组NLRP3免疫荧光染色及Western Blot结果。a：基底膜铺片显示各组小鼠耳蜗毛细胞NLRP3表达情况。通过鬼笔环肽标记毛细胞（绿色荧光），NLRP3（红色荧光），DAPI标记细胞核（蓝色荧光），噪声组NLRP3（箭头所指）荧光强度较其他两组强；b：各组小鼠耳蜗NLRP3 Western Blot结果。从左至右分别为对照组、噪声组噪声后1天、噪声+氢气组噪声后1天、噪声组噪声后7天、噪声+氢气组噪声后7天；c：各组NLRP3蛋白含量，n=18。*与对照组比P<0.05;#与噪声组7天比P<0.05.对照组（Ctrl）、噪声组（NE）和噪声+氢气组（NE+HR）。Fig.1 Immunofluorescence and Western Blot results of NL‐RP3 in each group.a:Hair cells were labeled with phalloidin(green),NLRP3(red),nuclear was labeled with DAPI(blue),NLRP3 fluorescence intensity was increased in hair cells after noise exposure(arrow).b:Western Blot result of NLRP3 ex‐pression level of each group.c:NLRP3 expression of each group,n=18;*vs ctrl group,P<0.05;#vs NE 7 days,P<0.05.

2.2 噪声损伤及氢气干预对耳蜗caspase-1的影响

噪声后7天取基底膜进行免疫荧光，进行毛细胞与caspase-1共染色（图2a），对照组基底膜cas‐pase-1表达较低,噪声后毛细胞内caspase-1表达增强,噪声组噪声暴露后毛细胞caspase-1表达较噪声+氢气组更为明显。分别在噪声后1天、7天取耳蜗进行Western Blot实验，对照组耳蜗内caspase-1少量表达，与对照组相比，噪声组噪声后1天显著升高（P<0.05），噪声+氢气组表达升高但无统计学意义（图3b）。噪声后第7天噪声+氢气组比噪声组显著降低（P<0.05）（图2b，c）。

图2 各组caspase-1免疫荧光染色及Western Blot结果。a：基底膜铺片各组显示caspase-1表达情况。通过鬼笔环肽标记毛细胞（红色荧光），caspase-1（绿色荧光），DAPI标记细胞核（蓝色荧光），噪声组caspase-1（箭头所指）荧光强度较其他两组强；b：各组小鼠耳蜗caspase-1 Western Blot结果。从左至右分别为对照组、噪声组噪声后1天、噪声+氢气组噪声后1天、噪声组噪声后7天、噪声+氢气组噪声后7天；c：各组caspase-1蛋白相含量，n=18。*与对照组比P<0.05;#与噪声组7天比，P<0.05.对照组（Ctrl）、噪声组（NE）和噪声+氢气组（NE+HR）。Fig.2 Immunofluorescence and Western Blot results of cas‐pase-1 in each group.a:Hair cells were labeled with phalloi‐din(red),caspase-1(green),nuclear was labeled with DAPI(blue),caspase-1 fluorescence intensity was increased after noise exposure in hair cells(arrow).b:Western Blot result of caspase-1 expression level of each group.c:caspase-1 expres‐sion of each group,n=18;*vs ctrl group,P<0.05;#vs NE 7 days,P<0.05.

2.3 小鼠耳蜗淋巴液炎症因子浓度测定

与对照组相比,噪声组耳蜗淋巴液IL-1β（P<0.05）、IL-6升高（P<0.01），IL-10降低（P<0.05）。与噪声组相比噪声+氢气组IL-1β显著降低（P<0.05）、IL-6显著降低（P<0.01），IL-10显著增加（P<0.01）（图3）。

图3 各组耳蜗淋巴液中炎症因子浓度测定，n=18。a：IL-1β浓度柱状统计图；b：IL-6浓度柱状统计图；c：IL-10浓度柱状统计图。*P<0.05；**P<0.01.Fig.3 The concentrations of inflammatory factors in the lym‐phatic fluid of each group.a:The column chart of IL-1β con‐centration in each group.b:The column chart of IL-6 concen‐tration in each group,n=18.c:The column chart of IL-10 con‐centration in each group.*P<0.05;**P<0.01.

2.4 ABR测试结果

小鼠在噪声暴露前，暴露后1天和7天分别进行ABR测试。噪声暴露后噪声组及噪声+氢气组的ABR反应阈值较对照组显著升高（P<0.05），氢气干预1天后与噪声组相比ABR阈值无显著差异（P>0.05）。7天后两组小鼠听力均有不同程度恢复（图4），氢气干预后较噪声组降低，在24kHz阈值具有显著性（P<0.05）。

图4 对照组（红色）以及噪声组（蓝色）和噪声+氢气组（绿色）在噪声后7天ABR阈值，n=24（48 ears）。Fig.4 ABR thresholds of control group（red）,noise group（blue）and noise+hydrogen group（green）7 days after noise exposure ，n=24（48 ears）.

3 讨论

在日常生活及军事行动中，噪声对耳蜗的损伤及由此引起的听力下降比较常见。在我国现役歼击机的发动机舱口噪声强度在117～130dB（A）之间，有调查发现歼击机飞行员和地勤人员中有近半数存在高频听力下降[7]。针对目前部队训练、和工业活动中噪声暴露影响着众多年轻人，且缺乏有效的药物用于噪声性耳聋防治。在此研究中我们使用120dB SPL的噪声强度，是军事活动和工厂作业中常能达到的水平，可以造成小鼠听力永久性阈移[8]。

噪声可以引起强氧化作用的自由基在内耳堆积，促使炎症因子与趋化因子介导耳蜗炎症细胞聚集，是噪声性耳聋发病的重要机制之一[9-11]。近年来发现炎症复合体NLRP3在内耳炎症中扮演重要角色[12,13]。NLRP3包括由识别分子、连接分子和效应分子组成，在正常细胞中普遍表达，但只有过表达到一定程度时，才会引起下游炎症因子释放[14,15]。Toll-like receptors（TLR）、含核苷酸结合寡聚化结构域的蛋白2（NOD2）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）受体和肿瘤坏死因子（TNF）受体参与了NLRP3基因的转录启动。这些受体激活后引起转录因子的升高,可以和核因子NF-κB共同促进多种促炎基因的转录,释放更多炎症因子。

噪声后NLRP3和caspase-1在小鼠耳蜗毛细胞中表达增加,二者在噪声后1天即显著升高，7天后下降并接近噪声前水平，说明NLRP3参与了噪声早期对毛细胞的损伤过程，并可能存在caspase-1介导的“细胞焦亡”[16]。过度表达的NLRP3剪切pro-caspase-1成为有活性的caspase-1，直接或间接促发释放IL-1、IL-6等多种促炎性细胞因子。IL-1β可以通过激活MAPK/JNK信号通路，引起线粒体功能障碍和毛细胞凋亡[17]。IL-6则通过募集免疫细胞损伤听觉神经上皮细胞[18]，引起听力损失。耳蜗淋巴液中的炎症因子浓度可以很好的反映内耳炎症程度，噪声后第7天淋巴液中的IL-1β和IL-6仍显著高于对照组，说明噪声引起的炎症损伤过程仍在持续。

氢气作为一种安全无害的小分子气体，目前已被证实具有抗炎和抗氧化作用。研究发现氢气可以有选择的清除有害自由基,对保持细胞正常功能而毒性较弱的过氧化氢、NO等作用较弱[19-22]，并可以抑制病理过程中炎症复合体的表达，从而减轻炎症反应[23]。氢气良好的抗炎效果已得到临床试验验证，安全无害的特点使其具有广阔的临床前景[24]。文献报道氢气可以抑制脑损伤、缺血再灌注和肿瘤等多种疾病中炎症复合体的表达[25-27]，并在炎症病理过程中发挥显著的抑制作用，但氢分子抑制内耳炎症的作用机制与靶点尚不完全清楚。近期研究发现氢气对噪声引起的毛细胞缺失具有很好的防护效果，在给予2小时的氢气吸入后进行噪声暴露，可以发挥最大保护效果[28]。本研究中噪声+氢气组ABR阈值均比噪声组降低，但只有24kHz具有显著性，下一步应当增加样本量以完善听力结果。此外，我们还检测了小鼠耳蜗淋巴液中抑炎因子IL-10的浓度，发现噪声后IL-10的含量显著降低而氢气干预后IL-10的浓度显著升高。氢气引起IL-10升高的机制仍需进一步的研究。

综上所述,噪声后小鼠耳蜗内NLRP3激活并损伤毛细胞,抑制NLRP3激活可能是氢气起到预防作用的分子靶点，进而减少了毛细胞凋亡，保护听力。下一步我们将开展氢气防治军事噪声性耳聋的临床试验，探索氢气保护听力的临床价值。