吕明珊，袁艺洋，邢军，王亮，艾合买提江·艾海提，茹先古丽·买买提依明*

(1.新疆大学 生命科学与技术学院，乌鲁木齐 830046；2.华南农业大学 食品学院，广州 510642)

新疆药桑在植物分类学上属桑科(Moraceac)、桑属(MorusL.)、黑桑种(MorusnigraL.)[1]，是新疆特有生长环境下的桑种资源。药桑葚富含多种氨基酸和固形物等营养物质，是新疆地区的民间药材。药桑性寒、无毒，具有保肝护肝，治疗耳眼不灵，缓解风湿性关节疼痛等药用价值。药桑葚中多酚类化合物[2-3]、还原糖含量、总黄酮[4]和维生素含量均高于其他桑葚。但药桑葚属于季节性果蔬，果肉软嫩多汁，不易储存及运输，常被加工成果酒、果醋、果酱、冰淇淋、糖浆等[5]。但药桑葚酵素这种生物发酵制品却很少见，与之相关的文献也不多。

酵素是一种利用微生物进行发酵得到的保健食品，其采用各种水果、蔬菜，经过前处理后使用乳酸菌进行发酵，其产物富含各种有机酸[6]、维生素、多酚类化合物等。且果蔬汁经过发酵后较好地丰富了其原本的口感，发酵时产生的发酵产物还能起到调节肠道菌群、促进消化、抗炎、抗氧化等作用[7-8]。以药桑葚为原材料制作酵素不但解决了药桑葚不易储存的问题，而且能满足消费者们对营养的需求。现报道的新疆药桑葚发酵果汁的发酵工艺多为单菌发酵，但是近年来有研究发现混菌发酵更能丰富酵素的营养和口感，不同乳酸菌发酵时利用碳水化合物产生乳酸等有机酸和风味物质，使酵素的口感更佳[9]。

超氧化物歧化酶(SOD)是人体内一种抗氧化酶，具有抗衰、抗疲劳的效果[10]，同时也是评判酵素营养价值的重要指标，从药桑葚中提取出的酚类化合物被证实拥有较强的自由基清除能力[11]，故而以总酚质量浓度和SOD活力为指标优化发酵工艺。本实验通过研究药桑葚酵素工艺优化提高酵素内SOD活力、总酚含量，得到最优的药桑葚酵素发酵工艺条件，并研究用最优工艺条件制得的药桑葚酵素样品的SOD值、总酚含量及抗氧化能力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药桑葚：新疆阿克苏地区库车市生产；乳酸菌：中国微生物菌种保藏中心；福林酚试剂(1 mol/L)：上海源叶生物科技有限公司；没食子酸标准品(HPLC≥98%)：天津市盛奥化学试剂有限公司；MRS肉汤培养基：北京奥博星生物技术有限公司；果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶：诺维信有限公司。

1.2 仪器与设备

DHP-9052恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司；WZS手持式糖度计 上海仪电物理光学仪器有限公司；HH数显恒温水浴锅、KX-101恒温干燥箱、RH-QG全温振荡器/摇床 江苏科析仪器有限公司；1004分析天平 上海越平科学仪器有限公司；SW-CJ-2G超净工作台 上海沪净医疗器械有限公司；LS-150LD立式压力蒸汽灭菌器 江阴滨江医疗设备有限公司；UV752紫外可见分光光度计 上海佑科仪器仪表有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 药桑葚酵素工艺流程

新鲜的药桑葚→打浆→酶解→调固形物→灭酶→(菌种→活化→扩大培养)接种→发酵→终止发酵→罐装→4 ℃储藏。

1.3.1.1 菌种活化及培养

乳酸菌：MRS液体培养基，在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，传代2～3次备用。

1.3.1.2 药桑葚酵素工艺要点

经过之前的工作，确定了最佳的药桑葚发酵菌种配方为鼠李糖乳杆菌∶副干酪乳杆菌为1∶3，本文将应用这一配方进行药桑葚酵素的工艺条件优化和抗氧化性评估。

选取紫色、成熟的药桑葚，剔除病害果。使用破壁机打浆，将果汁放入1000 mL三角瓶中，酶添加量0.4%(果胶酶∶纤维素酶∶半纤维素酶为2∶1∶1)后放置在55 ℃恒温水浴锅内酶解3 h，调固形物，85 ℃灭酶30 min，冷却至37 ℃接种，药桑葚汁中菌密度为8.33×106CFU/mL，然后用胶塞封闭瓶口进行厌氧发酵，发酵时间为16.4 h。

1.3.2 测定方法

1.3.2.1 总酚质量浓度的测定

总酚质量浓度的测定采用福林酚法[12]。采用0～0.02 mg/mL的没食子酸标准溶液制作标准曲线，得线性回归方程为：y=0.8686x+0.0053(x为没食子酸质量浓度，mg/mL；y为吸光值)，R2=0.9987。根据线性回归方程计算样液的总酚质量浓度。

1.3.2.2 SOD活力的检测

利用SOD活力检测试剂盒进行检测。

1.3.2.3 羟自由基清除率的测定[13]

药桑葚酵素用去离子水稀释，配制成浓度为10，20，30，40，50 mg/mL的酵素稀释液；每组取0.5 mL 9 mmol/mL FeSO4溶液，0.5 mL 9 mmol/mL水杨酸溶液加入已标记的试管中，摇匀，分别加入1 mL不同浓度的酵素溶液，空白组加入1 mL去离子水，最后加入0.5 mL 9 mmol/mL H2O2溶液，摇匀后于37 ℃水浴避光加热反应15 min后取出，用去离子水代替H2O2溶液的本底作为参比在510 nm处测定吸光度值。

式中：W为羟自由基清除率；A0为空白组吸光度；A1为实验组吸光度；A2为参比吸光度。

1.3.2.4 DPPH自由基清除率的测定[14]

药桑葚酵素用去离子水稀释，配制成浓度为10，20，30，40，50 mg/mL的酵素稀释液；每组取2 mL 0.2 mmol/mL DPPH溶液(由无水乙醇配制)加入标记好的试管中，再分别加入2 mL不同浓度的酵素溶液，空白组加入等量去离子水；常温下避光反应30 min，以无水乙醇代替DPPH溶液的本底作为参比，测定其在517 nm下的吸光度值。

式中：W为DPPH自由基清除率；A0为空白组吸光度；A1为实验组吸光度；A2为参比吸光度。

1.3.3 单因素实验

1.3.3.1 发酵时间的选取

在发酵温度37 ℃，总乳酸菌接种量6×106CFU/mL，固形物添加量1.5 °Brix，总酶添加量0.4%，酶解时间3 h，测定发酵时间0，3，6，9，12，15，18，21 h时发酵液的SOD活力及总酚含量。

1.3.3.2 最佳发酵温度的选取

其他条件同1.3.3.1，测定发酵时间15 h，发酵温度27，32，37，42，47 ℃时5个样品中发酵液的SOD活力及总酚含量。

1.3.3.3 最佳接种量的选取

其他条件同1.3.3.1，测定发酵时间15 h，总乳酸菌接种量1×106，3×106，6×106，9×106，12×106，15×106CFU/mL时6个样品中发酵液的SOD活力及总酚含量。

1.3.3.4 最佳固形物添加量的选取

其他条件同1.3.3.1，测定发酵时间15 h，固形物添加量0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 °Brix时7个样品中发酵液的SOD活力及总酚含量。

1.3.4 响应面优化药桑葚酵素工艺

在单因素实验的基础上，使用Design Expert软件，根据Box-Behnken的中心组合设计原理，选择发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、固形物添加量(D)为自变量，以发酵液的SOD活力、总酚含量为响应值，采用响应面分析法，设计四因素三水平实验，因素水平见表1，对药桑葚酵素发酵工艺参数进行优化。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平

1.4 数据处理与分析

所有数据均为3次以上实验的平均值±标准误差。实验数据采用SPSS 24.0进行分析,使用GraphPad Prism 8进行作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 发酵时间对发酵液的影响

图1 发酵时间对发酵液中SOD活力和总酚含量的影响Fig.1 Effect of fermentation time on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

实验所用乳酸菌进入对数生长期所需时间为6 h，进入稳定期所需培养时长为12 h，酵素中发酵产物随着时间的增加不断积累。由图1可知，3～15 h，SOD活力迅速增长，SOD活力在15 h时达到最大值313 U/g，18 h后SOD活力呈现缓慢降低的趋势。总酚质量浓度在12 h时达到最大值8.58 mg/g，随着时间继续增加，总酚质量浓度下降至7.58 mg/g，所以选择发酵时间15 h较为合理。

2.1.2 发酵温度对发酵液的影响

图2 发酵温度对发酵液中SOD活力和总酚含量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

发酵温度是影响SOD值和总酚质量浓度的关键因素，由图2可知，随着温度的升高，SOD活力在37 ℃时达到最高值311 U/g，随着温度继续升高，SOD值持续下降。总酚质量浓度在32～37 ℃持续升高直至37 ℃时达到最高值8.52 mg/g，37 ℃后呈下降趋势。乳酸菌的适宜生长温度一般在30～37 ℃，两者的下降可能是由于温度过高影响菌体生长，导致SOD活力和总酚合成能力下降，因此最佳发酵温度为37 ℃。

2.1.3 接种量对发酵液的影响

图3 接种量对发酵液中SOD活力和总酚含量的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

由图3可知，当乳酸菌接种量较低时，其生长代谢速度缓慢，代谢产物的SOD活力和总酚含量都明显较低，当接种量达到6×106CFU/mL时，乳酸菌生长代谢速度适中，SOD活力达到最大值311 U/g，总酚质量浓度也达到最大值8.59 mg/g。当接种量增至9×106CFU/mL时，相较接种量6×106CFU/mL无显著差异。当接种量达到1.2×107CFU/mL时，因为乳酸菌的生长代谢速度过快，发酵过度，总酸含量过高，从而影响SOD活力。适当增加乳酸菌含量，其代谢产物有机酸和固形物的存在有利于酚类物质的溶出。同时，大分子酚类物质降解成小分子酚类物质也能够增加总酚的质量浓度[15]，故选择接种量为6×106CFU/mL最佳。

2.1.4 固形物添加量对发酵液的影响

图4 固形物添加量对发酵液中SOD活力和总酚含量的影响Fig.4 Effect of solids additive amount on SOD activity and total phenol content in fermentation broth

由图4可知，SOD活力随着固形物添加量的增高呈现上升趋势，但总体变化趋势不明显。随着固形物添加量增大至1.5 °Brix，SOD活力达到最大值316 U/g。总酚质量浓度随着固形物添加量的增高在1.5 °Brix时达到最大值8.58 mg/g，随着固形物添加量的继续增高，总酚质量浓度迅速下降，故选择1.5 °Brix固形物添加量较为合适。

2.2 响应面法优化药桑葚酵素发酵工艺

2.2.1 响应面实验方差分析及结果

在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合设计原理，选取发酵时间(A)、发酵温度(B)、乳酸菌接种量(C)和固形物添加量(D)作为响应面优化的考察因素，以产品的SOD活力和总酚质量浓度为响应值，设计四因素三水平实验，实验结果见表2。

表2 响应面实验结果Table 2 The experimental results of response surface

续 表

采用 Design-Expert 8.0.6 软件进行多元回归拟合，得出SOD活力(Y1)和总酚质量浓度(Y2)对发酵时间(A)、发酵温度(B)、接种量(C)、固形物添加量(D)的二次多项回归方程为分别为：

Y1=317.75+23.81A+11.17B+15.65C+9.36D-5.49AB-1.21AC-2.39AD+1.33BC+1.29BD+3.81CD-20.59A2-24.49B2-12.66C2-9.18D2。

(1)

Y2=8.90+0.34A-0.11B+0.22C+0.19D-0.022AB-7.500E-003AC-2.500E-003AD-0.067BC-5.000E-003BD-0.020CD-0.51A2-0.46B2-0.093C2-0.097D2。

(2)

式(1)、式(2)中：Y1为SOD活力，Y2为总酚质量浓度，A为发酵时间，B为发酵温度，C为接种量，D为固形物添加量。

SOD的方差分析和显著性检验结果见表3。

表3 SOD活力回归模型方差分析及显著性检验

续 表

表4 总酚质量浓度回归模型方差分析及显著性检验Table 4 Analysis of variance and significance test of regression model of total phenol concentration

由表3和表4可知，两个回归方程模型极显著(P<0.0001)，失拟项检验结果不显著。相关系数R2(SOD活力)是0.9914，R2(总酚质量浓度)是0.9706，表明SOD活力和总酚质量浓度的实测值和预测值之间拟合度较好，所以此模型拟合效果好，可用来分析预测乳酸菌发酵药桑葚酵素的工艺参数。

各因素对SOD活力的影响为 A(发酵时间)>C(接种量)>B(发酵温度)>D(固形物添加量)，各因素对总酚质量浓度的影响为A(发酵时间)>C(接种量)>D(固形物添加量)>B(发酵温度)。

2.2.2 响应面分析各因素交互作用对发酵药桑葚汁SOD活力和总酚质量浓度的影响

a.发酵温度和发酵时间对SOD活力的交互影响

b.发酵温度和固形物添加量对SOD活力的交互影响

c.接种量和固形物添加量对SOD活力的交互影响

d.发酵时间和发酵温度对总酚含量的交互影响

由图 5可知，发酵时间与发酵温度、接种量与固形物添加量的交互作用对SOD活力影响的显著性与表3中交互项P值的分析结果一致。此外，等高线的形状亦可以判断交互作用的强弱，由图5中b可知，发酵温度与固形物添加量的交互作用也显现出显著性良好的椭圆形，等高线的顶点就是响应值SOD活力的最大值。a，b，c，d的响应面图像均开口朝下，表明两个响应值随着各个因素值的增大而呈现出增大的趋势，达到响应值最大值后，响应值即随着因素值的增大而减小，此时，响应面的顶点处为响应值的最大值。

经Design-Expert 8.0.6软件分析得到的最佳优化条件为发酵时间为16.37 h，发酵温度36.23 ℃，乳酸菌接种量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.59 °Brix。采用这一结果并结合实际条件，发酵条件改为：发酵时间为16.4 h，发酵温度36 ℃，乳酸菌接种量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.6 °Brix，得到的试验结果为SOD活力329 U/g，总酚含量9.11 mg/g。与理论预测值基本一致，建立的模型很好地提高了发酵产物的SOD活力，同时也保证了总酚的质量浓度处于较高水平，模型较好地反映了发酵温度和发酵时间是对发酵结果影响最大的因素。

2.3 抗氧化性实验结果

2.3.1 药桑葚酵素对羟自由基的清除能力

图6 药桑葚酵素对·OH清除能力Fig.6 The scavenging ability of Morus nigra L. enzyme on ·OH

羟自由基具有较强的抗氧化能力是评判样品抗氧化性的一个重要指标。由图6可知，药桑葚酵素对羟自由基有很强的清除作用，并且随着药桑葚浓度增至40 mg/mL时羟自由基清除率达到最大值93.71%。结果表明，药桑葚酵素具有羟自由基清除能力，且随着药桑葚浓度的增加清除率随之增加。

2.3.2 药桑葚酵素对DPPH自由基的清除能力

图7 药桑葚酵素对DPPH·清除能力Fig.7 The scavenging ability of Morus nigra L. enzyme on DPPH·

DPPH自由基是一种稳定的自由基，当具有抗氧化性的物质进入DPPH溶液中时，其吸光值会发生改变。由图7可知，药桑葚酵素对DPPH自由基的清除率随着酵素浓度的升高而升高，加入低浓度酵素样品时即表现出很强的自由基清除能力(90.85%)，当药桑葚酵素浓度为30 mg/mL时清除率稳定在97%左右，说明药桑葚酵素对DPPH自由基的清除能力很强。

3 结论

这项工作通过单因素实验确定了药桑葚酵素混菌发酵响应面实验的条件，并利用SOD活力、总酚质量浓度双响应值联合确定了药桑葚酵素混菌发酵的最佳条件：发酵时间为16.4 h，发酵温度36 ℃，乳酸菌接种量8.33×106CFU/mL，固形物添加量1.6 °Brix。得到的试验结果为SOD活力329 U/g，总酚含量9.11 mg/g。并对所得到的药桑葚酵素进行抗氧化性评估，DPPH自由基最大清除率达到97%，羟自由基清除率最大值为93.71%。药桑葚酵素具有良好的抗氧化性，作为一种酵素饮品可以很好地满足人们对营养的需求。