班雯婷，胡彪，康佩姿，刘娟

(广东省科学院生物工程研究所，广州 510310)

随着人们对健康的重视，国内外对研发安全性高、无热量、成本低、适于糖尿病与肥胖症患者食用的甜味剂如低聚果糖的需求迫在眉睫。低聚果糖又称蔗果低聚糖[1-4]，是由1～3个果糖基通过糖苷键与蔗糖分子相连构成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。低聚果糖具有优越的生理功能：调节肠道菌群， 降低血脂，增强免疫力，低热量，抗龋齿，润肠通便，促进矿物质的吸收。

低聚果糖的来源主要有两种：一种来自植物，一种来自微生物酶法合成。微生物酶法合成是指以微生物发酵产果糖基转移酶来转化蔗糖生产低聚果糖的方法。果糖基转移酶主要来源于酵母[5]和霉菌[6-7]。微生物发酵法不受季节性限制且成本低、效率高，是目前工业生产低聚果糖的主要方式。

法夫酵母是一种高附加值菌种，能发酵生产葡萄糖、胡萝卜素、虾青素等，为进一步的联产实验提供了支持，此外有报道证明[8]，法夫酵母在蔗糖培养基的生长过程中会发生果糖基转移作用而生成一种新型三糖，这种新型蔗果三糖被命名为新科斯糖(neokestose)，研究表明[9]，新科斯糖增殖双歧杆菌的能力比一般商业用低聚果糖更优越。

目前，法夫酵母生产新科斯糖的研究在国外较少涉及，国内主要是江南大学进行研究[10]，法夫酵母生物量最高达到11.46 g/L，发酵生产新科斯糖最高产量为 250.37 g/L，蔗糖转化率达到85%。

催化合成新科斯糖的酶是6G-果糖苷酶，研究表明[11]，底物浓度、底物pH、接种量、酶处理温度和时间等单因素对蔗糖的转化和生成新科斯糖均有影响，温度对6G-果糖苷酶产新科斯糖的现象与胞外半乳糖酶的类似[12]；过高的接种量使黏度增加，不利于酵母呼吸，抑制酵母生长[13-16]；6G-果糖苷酶既有果糖基转移作用又有水解作用，蔗糖浓度增加，水分活度降低，水解作用减弱，果糖基转移作用增强，新科斯糖产量升高，但蔗糖增加，新科斯糖产率下降[17]；磷酸盐和柠檬酸盐对法夫酵母的生长有促进作用。

目前新科斯糖的生产都采用微生物法，微生物法又可以分为酶法和全细胞法。由于游离全细胞可以避免固定化导致的酶活损失，且与固定化细胞相比，在产糖过程中糖的转化不受质量转移限制，因此显示了较好的工业化生产潜力。

金属离子参与多种生化反应[18-19]，可使底物结合到酶的活性部位，也可间接使酶的活性部位保持在易结合底物的构象。金属离子直接影响酶的活性，进而影响发酵生物量，最终影响目标产物的积累量。

真菌诱导子(fungal elicitor)是一类能诱导植物和微生物产生次级代谢产物的活性物质，它一经识别，将通过信号转导途径，引起相关基因表达发生变化，从而调节次级代谢产物合成途径中相关酶的活性，诱导特定次级代谢产物的积累。Wang等[20]研究表明真菌诱导子对法夫酵母生长和类胡萝卜素合成有一定影响。本文以此为依据，考察不同生物和化学诱导子对法夫酵母生长和新科斯糖合成的影响。

1 材料与方法

1.1 菌种

法夫酵母：购于广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 培养基

法夫酵母种子培养基：葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨0.5%，pH 7。

法夫酵母发酵培养基：葡萄糖2%，硫酸铵0.7%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.2%，氯化钙0.03%，酵母粉0.2%，YNB 0.1%，pH 7。

生物诱导子培养基：葡萄糖2%，氯化铵1%，磷酸二氢钾0.4%，磷酸二氢钠0.1%，硫酸镁0.2%，pH 5。

1.3 真菌诱导子的制备

灵芝、平菇、秀珍菇、茶树菇培养7 d后，分别收集20 g湿菌体，用蒸馏水、0.1 mol/L和0.5 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2)分别洗涤3次，超声破碎细胞，离心(4000 r/min，5 min)收集沉淀，用0.5 mol/L PBS缓冲液(pH 7.2)洗涤沉淀3次，重悬于蒸馏水中，121 ℃，20 min高压蒸汽灭菌后，于-20 ℃保存。

1.4 化学诱导子的制备

金属离子、硝酸铈、氯化镉、茉莉酸甲酯配成一定浓度备用。

1.5 细胞的制备

将法夫酵母接种于装有25 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，于25 ℃，200 r/min培养48 h作为种子液。然后以10%的接种量接入装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，恒定pH 7.0，30 ℃下发酵 72 h，将菌体细胞用无菌水洗涤2次，3000 g，10 min离心收集湿细胞。

1.6 新科斯糖的制备

将湿细胞加入1 L蔗糖溶液中，置于摇床中25 ℃，细胞浓度100 g/L，蔗糖浓度400 g/L，150 r/min振荡反应 6 h。反应液于10000 g离心10 min，收集上清液，测定新科斯糖的产量。

1.7 法夫酵母生物量的测定

取5 mL菌液离心(4000 r/min，5 min)后用蒸馏水洗涤3次，在60 ℃烘箱中烘干至恒重后称重。

1.8 新科斯糖含量的测定

采用HPLC分析上清液，条件为色谱柱：安捷伦5NH2-MS(4.6 mm×250 mm)；柱温：35 ℃；流动相：乙腈∶水为75∶25；流速：1 mL/min；检测器：示差折光检测器；进样体积：10 μL。

2 结果与分析

在法夫酵母生长和新科斯糖积累阶段分别在培养基中添加不同真菌、化学诱导子，研究它们对法夫酵母生长和新科斯糖合成的影响。

2.1 生物诱导子对发酵生产新科斯糖的影响

2.1.1 灵芝添加量对发酵生产新科斯糖的影响

由图1可知，添加灵芝作为真菌诱导子时，对法夫酵母生物量和新科斯糖积累量有一定的影响，当灵芝添加量为10 mg/L时，生物量达到最大值13.90 g/L，提高了12.50%；当灵芝添加量大于或小于10 mg/L时，对酵母细胞生长的促进作用并不明显；当灵芝添加量小于10 mg/L时，新科斯糖积累量逐渐升高；当灵芝添加量为10 mg/L时，新科斯糖积累量达到219.23 g/L；相比对照组提高了11.85%；当灵芝添加量大于10 mg/L时，新科斯糖积累量逐渐降低，可见诱导体系中灵芝作为真菌诱导子存在最适质量浓度。

图1 灵芝对生物量和新科斯糖积累量的影响Fig.1 The effect of Ganoderma lucidum on the biomass and neokestose accumulation

2.1.2 平菇添加量对发酵生产新科斯糖的影响

图2 平菇对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图2可知，添加平菇作为真菌诱导子时，随着平菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐升高，当平菇添加量为20 mg/L时，生物量达到最大值13.48 g/L，相比对照组提高了12.11%，然后生物量略有降低，但变化不大；随着平菇添加量的增加，新科斯糖的积累量逐渐升高，当平菇添加量为30 mg/L时，新科斯糖的积累量达到最大值224.56 g/L，相比对照组提高了15.08%，然后随着浓度的继续增加，新科斯糖的积累量降低，可见过高的质量浓度反而影响了新科斯糖的合成。

2.1.3 秀珍菇添加量对发酵生产新科斯糖的影响

图3 秀珍菇对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图3可知，添加秀珍菇作为真菌诱导子时，随着秀珍菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐升高，当秀珍菇添加量为5 mg/L时，生物量达到最大值12.03 g/L，相比对照组提高了7.81%，虽然生物量有所增加，但是增加并不明显，可见秀珍菇作为真菌诱导子对细胞生长的促进作用有限；但随着秀珍菇添加量的增加，新科斯糖的积累量逐渐升高，当秀珍菇添加量为10 mg/L时，新科斯糖积累量达到最大值232.70 g/L，相比对照组提高了19.03 %，然后随着浓度的继续增加，新科斯糖的积累量降低。

2.1.4 茶树菇添加量对发酵生产新科斯糖的影响

图4 茶树菇对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图4可知，添加茶树菇作为真菌诱导子时，随着茶树菇添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐升高，当荼树菇添加量为10 mg/L时，生物量达到最大值12.06 g/L，相比对照组提高了7.99%；随着茶树菇添加量的增加，新科斯糖的积累量逐渐升高，当茶树菇添加量为20 mg/L时，新科斯糖的积累量达到最大值215.59 g/L，相比对照组提高了9.87%，然后随着浓度的继续增加，新科斯糖的积累量降低，相比其他真菌诱导子，茶树菇对细胞的生长和新科斯糖的积累都没有明显的促进作用。

2.2 化学诱导子对发酵生产新科斯糖的影响

2.2.1 金属离子对发酵生产新科斯糖的影响

将2 mg/L的金属离子分别添加到细胞培养过程和新科斯糖的积累过程中，其结果见图5。

图5 金属离子对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图5可知，在培养基中添加Zn2+和Mn2+能明显促进细胞生长，法夫酵母生物量分别提高了26.71%和16.71%，添加K+、Ca2+、Al3+和Mg2+对细胞生长的作用并不明显，添加Ag+离子后细胞生物量降低，可见酵母对重金属Ag+离子的吸附作用抑制了其生长。在新科斯糖积累过程中，Mg2+和Zn2+的作用最为明显，新科斯糖积累量分别增加了8.49%和5.95%，可见Mg2+和Zn2+作为多种酶的激活剂，可显著提高法夫酵母产新科斯糖的果糖基转移酶活性，而其他金属离子提高果糖基转移酶活性的作用并不明显。

2.2.2 硝酸铈添加量对发酵生产新科斯糖的影响

由图6可知，添加硝酸铈作为化学诱导子时，随着硝酸铈添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐降低，可见添加硝酸铈会抑制细胞生长，而在新科斯糖积累过程中，当硝酸铈添加量为0.16 mg/L时，新科斯糖积累量最高，为211.23 g/L，相比对照组提高了9.97%，然后随着硝酸铈浓度的增加，新科斯糖的积累量显著降低，可见硝酸铈在添加量小于0.16 mg/L时，可以增强果糖基转移酶的活性，当浓度升高时，会抑制酶的活性。

图6 硝酸铈对生物量和新科斯糖积累量的影响

2.2.3 氯化镉添加量对发酵生产新科斯糖的影响

图7 氯化镉对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图7可知，添加氯化镉作为化学诱导子时，随着氯化镉添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐降低，可见添加氯化镉会抑制细胞生长，而在新科斯糖积累过程中，当氯化镉添加量为0.12 mg/L时，新科斯糖的积累量最高，为218.72 g/L，相比对照组提高了14.08%，然后随着氯化镉浓度的增加，新科斯糖的积累量显著降低，可见氯化镉在添加量小于0.16 mg/L时，可以增强果糖基转移酶的活性，当浓度升高时，会抑制酶的活性。

2.2.4 茉莉酸甲酯添加量对发酵生产新科斯糖的影响

图8 茉莉酸甲酯对生物量和新科斯糖积累量的影响

由图8可知，添加茉莉酸甲酯作为化学诱导子时，随着茉莉酸甲酯添加量的增加，法夫酵母的生物量逐渐升高，当茉莉酸甲酯添加量为0.08 mg/L时，生物量达到最大值12.62 g/L，相比对照组提高了12.12%；在新科斯糖积累过程中，当茉莉酸甲酯添加量为0.08 mg/L时，新科斯糖的积累量最高，为202.13 g/L，相比对照组提高了5.91%。

3 结论与讨论

供试真菌诱导子对法夫酵母新科斯糖积累均有一定的促进作用，灵芝、平菇、秀珍菇和茶树菇制备的诱导子分别在添加浓度为10，20，5，10 mg/L时法夫酵母生物量最高，分别比对照提高了12.50%、12.11%、7.81%和7.99%；灵芝、平菇、秀珍菇和茶树菇制备的诱导子分别在添加浓度为10，30，10，20 mg/L时新科斯糖含量最高，分别比对照提高了11.85%、15.08%、19.03%和9.87%。可见，在最佳浓度下，灵芝和平菇对法夫酵母细胞生长比较有利，平菇和秀珍菇对新科斯糖的积累比较有利，推测真菌能够促进新科斯糖的生物合成是由于诱导子中含有促进法夫酵母类生长和新科斯糖合成的因子，它们能够产生一些特殊的酶系而可利用木质素生长，但其机理尚不明确，还需要进一步探究分析。

供试化学诱导子均有利于新科斯糖的积累，2 mg/L的Mn2+和Zn2+能明显促进细胞生长，法夫酵母的生物量分别提高了26.71%和16.71%，新科斯糖的积累量增加了9.56%和5.18%。

添加硝酸铈和氯化镉后，均会抑制法夫酵母细胞生长，可见硝酸铈和氯化镉对细胞生长具有一定的毒性，添加茉莉酸甲酯后，在最佳浓度0.08 mg/L下，生物量比对照组提高了12.12%，硝酸铈、氯化镉和茉莉酸甲酯诱导子在添加浓度为0.16，0.12，0.08 mg/L时，新科斯糖的积累量最高，分别比对照提高了9.97%、14.08%和5.91%，推测低浓度的硝酸铈和氯化镉能够与影响法夫酵母中果糖基转移酶表达的某些蛋白相互作用，其机理还需要进一步研究，茉莉酸甲酯本身具有诱导作用，可以促进细胞的生长和新科斯糖的积累。

综上所述，生物诱导子能促进法夫酵母的生长，从而显著提高新科斯糖的产量。化学诱导子对生长有一定的促进或抑制作用，但均可以提高新科斯糖的积累量。