不同提取方式八角籽油的香气分析
2022-02-25刘慧勤谭玉莹黄炯丽汤星月吴建文李秋庭
刘慧勤，谭玉莹，黄炯丽，汤星月，吴建文，李秋庭*
(1.广西大学 轻工与食品工程学院，南宁 530004；2.广西林业科学院，南宁 530002)
八角主产于我国西南部，是重要的木本科香料，广泛应用于食品调味、中药材等，也是提取茴香脑和莽草酸的主要原料[1-3]。2012年广西八角年产量约20万吨，占世界八角年产量的85%左右，八角籽占整果质量的20%左右[4]。八角作为一种药食同源的香辛料，其独特的气味在烹饪过程中起到去腥味、赋予食物多重香气的作用[5]。八角籽含有丰富的油脂及与八角壳相似的挥发性成分，在八角采摘、杀青、晾晒及干燥的过程中自行脱落，脱落后的八角籽一般被丢弃或当作肥料，造成了很大的资源浪费[6]。本文利用HS-SPME-GC-MS对冷榨、热榨及索氏提取八角籽油中的挥发性成分进行分析，采用面积归一化法计算每种挥发性成分的百分含量，然后将3种提取方式的油脂挥发性成分与八角精油进行对比，得出3种油脂中挥发性成分与八角精油中挥发性成分的差异。采用内标法对每种挥发性成分进行定量分析，结合气味阈值计算出每种挥发性成分的气味活性值(OAV)，以期得出不同八角籽油香气成分的含量差异、特征香气成分及对整体香气起主导作用的物质。
1 材料与仪器
1.1 实验材料
CP-SAO：将分离好的八角籽经粉碎，利用小型液冷榨油机对其进行冷榨，过滤后于4 ℃保存。
HP-SAO：将分离好的八角籽在130 ℃条件下炒籽15 min，利用小型中药粉碎机对其进行粉碎，液压榨油机进行压榨，过滤后于4 ℃保存。
SE-SAO：将八角籽粉碎至30目，置于索氏抽提装置，石油醚(60～90 ℃)于85 ℃下提取，回流7 h，回收溶剂后于4 ℃保存。
EO：八角果粉碎后，置于水蒸气蒸馏装置中，蒸馏2 h，水油分离后将精油部分于4 ℃保存。
1.2 实验试剂
环己醇、C7-C40正构烷烃：均购于上海麦克林生化科技有限公司。
1.3 实验仪器
萃取头50/30 μm DVB/CAR/PDMS、萃取手柄 上海安谱实验科技股份有限公司；7890B型气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦科技有限公司；HH-6数显恒温水浴锅 常州市朗博仪器制造有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 HS-SPME-GC-MS分析八角籽油挥发性成分
以峰面积和总峰数为依据进行前期实验研究，确定最佳萃取条件：(3±0.01) g油样于20 mL带有四氟乙烯垫片的顶空进样瓶中，添加3 μL环己醇作为内标。老化后的萃取头(老化温度260 ℃、时间40 min)插入60 ℃条件下平衡15 min的顶空进样瓶中，推出萃取纤维头，萃取30 min，将萃取头推进进样口进行解吸，解吸温度为250 ℃，时间为5 min。
气质联用仪器条件：色谱柱为DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.15 μm)，进样口温度250 ℃；流速1.0 mL/min；柱温升温程序：初始温度为40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升至120 ℃，再以8 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min。
质谱条件：EI离子源，电离电压70 eV，离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度250 ℃，扫描范围30～550 m/z。
1.4.2 定性及定量方法
定性方法：谱库检索和保留指数(retention index，RI)相结合进行定性。以美国国家标准与技术研究院(National Institute of Standards and Technology，NIST)14 质谱库检索进行对比，并要求匹配度达到80%以上。RI是以C7-C40正构烷烃混合标准溶液，并采用和样品相同的GC-MS条件，根据保留时间计算样品中化合物的保留指数，并与NIST Chemistry WebBook中相同色谱柱的同种物质的保留指数进行对比确认。保留指数计算公式如下：
(1)
式中：TX为化合物X的保留时间，Z和Z+1分别为化合物X出峰前后相邻正构烷烃标准品的碳原子数，TZ与TZ+1分别为Z和Z+1位碳原子对应正构烷烃的保留时间。
定量方法：面积归一化法、内标法，内标法定量计算公式如下：
(2)
式中：Mi为目标物的质量浓度(mg/kg)，V为内标物质的体积(μL)，P为内标物的密度(0.9624 g/mL)，St为目标化合物的峰面积，Si为内标物的峰面积，Mo为八角油脂质量(g)。
1.4.3 气味活性值(OAV)计算
OAV为化合物质量浓度与嗅觉阈值的比，一般用OAV表示呈香物质对总体香气的贡献大小，OAV大于1，表示该物质对总体香气的贡献较大，而当OAV小于1时则表示该物质对总体香气无实质性贡献[7]。某物质的OAV越大则该物质对总体香气的贡献越大。本文结合八角油中各成分的浓度及某种物质在水中的阈值(mg/kg)，计算出每种呈香物质的OAV，进而得出不同提取方式的八角籽油中的特征香气成分。计算公式如下：
(3)
式中：Ct为样品中香气成分的质量浓度，Co为该香气成分在水中的阈值。
1.5 数据分析
对所有实验结果采用SPSS 24软件进行单因素方差分析，结果均以平均值±标准差表示，采用Origin 2019作图，SAMIC 14进行主成分分析。
2 结果与分析
2.1 八角油脂与八角精油挥发性成分对比分析
经过GC-MS得出八角籽油和八角精油的色谱图，见图1。3种不同提取方式所得八角籽油和八角精油的挥发性成分百分含量见表1。分析鉴定出3种不同提取方式所得八角籽油中挥发性成分共91种，其中CP-SAO中鉴定出挥发性成分58种，HP-SAO鉴定出挥发性成分71种，SE-SAO中鉴定出挥发性成分59种，共有成分38种，分别为α-蒎烯、莰烯、正己醛、反式茴香脑和草蒿脑等，主要为芳香族和萜烯类物质。CP-SAO中芳香族物质19种，占总化合物的82.231%；单萜类物质22种，占总化合物的12.65%。CP-SAO中含量最高的物质为反式茴香脑，其次为草蒿脑、大茴香醛等；单萜类物质中含量最高的为柠檬烯，其次是芳樟醇、桧烯、4-萜烯醇等。HP-SAO中芳香族物质21种，占总化合物的74.98%；单萜类物质22种，占总化合物的20.7%；此外，还含有吡嗪、吡咯、呋喃类化合物，占总化合物的1.67%。HP-SAO中芳香族化合物含量最高的物质为反式茴香脑，其次为草蒿脑、大茴香醛等；单萜类物质中含量最高的为柠檬烯，其次为芳樟醇、桧烯等。杂环类中含量最高的为吡喃酮，其次为3-乙基-2，5-二甲基吡嗪、2-乙酰基吡咯。SE-SAO中主要含有的物质为芳香族、单萜类及烷烃类。其中芳香族物质24种，占总化合物含量的83.64%；单萜类物质12种，占总化合物含量的10.95%；烷烃类物质9种，占总化合物含量的2.68%。SE-SAO中芳香族化合物含量最多的为反式茴香脑，其次为草蒿脑、大茴香醛；单萜类物质含量最多的芳樟醇，其次为柠檬烯、桧烯；烷烃类物质中含量最高的2-甲基-十一烷、5-甲基-十一烷、4-甲基-十一烷。EO中芳香族化合物有20种，占总化合物含量的49.84%；单萜类物质有27种，占总化合物含量的44.22%。芳香族化合物中含量最高的物质为反式茴香脑，其次为草蒿脑和大茴香醛。单萜类物质中含量最高的为柠檬烯，其次为芳樟醇和α-蒎烯。
图1 3种八角籽油与八角精油色谱图Fig.1 The chromatograms of three kinds of star anise seeds oil and star anise essential oil
3种油样中共有33种，主要成分都为反式茴香脑、草蒿脑、芳樟醇、柠檬烯。EO中主要成分为反式茴香脑、柠檬烯、草蒿脑和芳樟醇。所以油脂中主要成分和精油的主要成分一样，但精油中单萜类物质含量多于油脂。
3种不同方式提取的八角油中挥发性物质具有一定的差异，HP-SAO、CP-SAO中共有成分最多，为50种，且与精油的共有成分一样(40种)。CP-SAO与HP-SAO中共有成分百分含量差异较小。HP-SAO还含有多种杂环等物质，这些物质应该是在高温炒籽过程中，八角籽中的蛋白质和糖类物质发生美拉德反应而产生的。SE-SAO中与EO中共有成分较少，且具有多种烷烃类物质，因此猜测烷烃类物质较多可能是因为烷烃类和石油醚相似相溶原理，单萜类物质明显较CP-SAO和HP-SAO中含量少，可能是因为SE-SAO中引入了过多的烷烃类物质，且这些烷烃类物质的出峰时间和单萜类物质的出峰时间比较接近，因此对GC-MS进行分离鉴定时掩盖了单萜类物质，或者是在溶剂回收过程中，真空高温(70 ℃)的条件使易挥发的单萜类物质随溶剂一起挥发的原因。
表1 八角籽油挥发性成分百分比含量表
续 表
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2.2 挥发性成分主成分分析
主成分分析是利用降维的方法将多个指标转化为少数综合性指标，这些综合性指标尽可能多地表达原有指标的信息，且保留了原指标的大部分信息，比单一评价更准确方便，避免性状间的相关性对评价结果的影响[8]。已经广泛应用于蔬果、药材等品质指标的筛选和综合评价研究[9]。双标图将载荷图和得分图结合到一个图形中，能够很直观地反映变量与变量、样本与样本、变量与样本之间的关系[10]。成分与样品的空间距离的大小表示物质成分影响的大小，样品间的空间距离远近反映样品间的差异。SAO中挥发性成分和EO的挥发性成分主成分分析双标图见图2，SAO与EO能够分离开，且在双标图上的距离较远，由此可以说明EO和SAO的挥发性成分差异较大。EO与CP-SAO的距离最短，其次为HP-SAO、SE-SAO，说明CP-SAO和EO的挥发性成分最接近，其次是HP-SAO、SE-SAO。CP-SAO、HP-SAO和SE-SAO也能够分离开，CP-SAO和HP-SAO间的距离最近，HP-SAO和SE-SAO的距离最远，表示CP-SAO和HP-SAO的挥发性成分最为接近，HP-SAO和SE-SAO的挥发性成分相差最大。图2中每种物质的序号与表1相对应，由此可以看出对CP-SAO影响最大的成分为β-松油烯和肉桂醇，对HP-SAO影响最大的成分为4-羟基丁酸乙酯、苯乙醛、E-4.8-二甲基-1,3,7-三烯、2-乙基-5-甲基吡嗪、D-荜澄茄烯等，对SE-SAO影响最大的物质主要为2,6-二甲基癸烷、2-甲基十一烷、2-甲基癸烷等烷烃类物质，对EO影响最大的物质为β-蒎烯、左旋樟脑、反式-p薄荷-2-烯-1-醇、β-法尼烯等物质。
图2 八角籽油挥发性成分主成分析双标图Fig.2 Principal component analysis dual plot of volatile components in star anise seeds oil
八角籽油和八角精油的挥发性成分的主成分分析的特征值和贡献率见表2，本实验根据累积贡献率不低于85%及特征值>1的原则[11]，明确了前3个主成分，其累积贡献率达94.6%，包含了原始数据的大部分信息，可代表八角籽油及八角精油挥发性成分。第一主成分的方差贡献率为48.7%，其中贡献最大的是葑烯，其次为(+)3-蒈烯、α-水芹烯等单萜烯类物质。第二主成分的方差贡献率为33.9%，贡献最大的是2-甲基-环戊醇，其次为顺-α,α-5-三甲基-5-乙烯基四氢化呋喃-2-甲醇、甲基庚烯酮类、β-罗勒烯等芳香族类及倍半萜类物质。第三主成分的方差贡献率为12.0%，贡献最大的为2-乙酰基吡咯，其次为2-乙基-5-甲基吡嗪、3-乙基-2,5-二甲基吡嗪等杂环类物质。
表2 主成分的特征值、贡献率和累计贡献率
2.3 八角籽油中香气成分含量分析
阈值对于食品香气分析研究十分重要，阈值越低表明该物质越容易被嗅闻到，相反，阈值越高则表明该物质越不容易被人鼻捕捉[12]。根据Guadagni气味活度值理论，物质浓度高的不一定对整体香气贡献大，而有些物质虽然物质浓度低，但对整体香气的贡献却较大，一般认为OAV大于1的挥发性物质对香气具有贡献，被称为特征香气成分，OAV越大则对香气的贡献越大[13]。参考文献[14]确定了55种香气物质的OAV值。CP-SAO中有39种呈香物质的OAV>1，因此这39种物质被称为特征香气成分，其中1
3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪、苯乙醛虽然在HP-SAO中含量较少，但因其OAV值较高，使HP-SAO具有独特烤香气。不同提取方式所得其八角籽油的特征香气成分与主导香气成分存在一定的差异，HP-SAO中特征香气成分最多，香味最为丰富，不仅具有八角味，而且具有独特的烤花生坚果香味，SE-SAO中特征成分最少，与CP-SAO与HP-SAO相比，单萜类物质分别少了286.439 mg/kg和221.57 mg/kg，而芳香族类化合物多了819.304 mg/kg和1619.234 mg/kg，SE-SAO中对整体香气起到修饰作用的物质较少，整体香气以芳香族的反式茴香脑(茴香味)、草蒿脑(类似茴香味)和大茴香醛(花香、茴香)的香气贡献为主，香气比较单一。CP-SAO中单萜类物质最多，因此整体香气与八角精油比较接近。
八角籽油香气成分、气味描述、气味阈值及香气活性值见表3。
表 3 八角籽油香气成分、气味描述、气味阈值及香气活性值
续 表
3 结论
3种不同方式提取的八角油中挥发性物质具有一定的差异，HP-SAO、CP-SAO与EO相同成分较多，且CP-SAO与HP-SAO中的共有成分百分含量差异性较小。HP-SAO除那些共有成分外，还含有多种具有烤香味的吡嗪、吡喃、吡咯等物质，这些物质应该是在炒制的高温过程中，八角籽中的蛋白质和糖类物质发生美拉德反应而产生的。SE-SAO中与EO中共有成分较少，且具有多种烷烃类物质，因此猜测烷烃类物质较多可能是因为烷烃类和石油醚相似相溶原理。SE-SAO中单萜类物质少于HP-SAO和CP-SAO，可能是因为SE-SAO中引入了过多的烷烃类物质，因此对GC-MS进行分离鉴定时掩盖了含量较少的非挥发性气味成分。苯乙醛和3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪为HP-SAO的焙烤坚果味的主要来源。HP-SAO的整体香气最为丰富，不仅含有较多和八角精油相似的呈香物质，而且含有苯乙醛、3-乙基-2,5-二甲基-吡嗪等多种美拉德反应后产生的具有坚果烤香味的物质。CP-SAO与EO的香气比较接近。
