常子惠，何文佳，多杰仁青，崔小梅，卫波宁，德 吉*

1西藏大学理学院；2西藏自治区农牧科学院水产科学研究所；3西藏藏医药大学，拉萨 850000

支气管炎主要是由支气管黏膜及周围组织的特异性反应而引起的炎症[1]，其发病周期长，致病主要受季节变化、病毒感染、过敏性感染等外部因素及呼吸道防御系统、免疫力降低等内部因素的影响[2]。

麻黄作为中药使用历史悠久，具有发汗散寒、利水消肿、宣肺平喘的功效[3]，是常用于支气管炎的中药，其含有多个活性成分。研究发现了麻黄与桂枝中药配伍中木犀草素、芹菜素、槲皮素等黄酮类化合物与TNF-α、LTB4靶点作用，从而起到治疗支气管炎的作用[4]，但挥发性成分是否对支气管炎有作用目前未报道。藏麻黄为西藏特有的麻黄属植物，其根、茎具有特殊香气。藏医古籍《晶珠本草》[5]记载 “才屯(麻黄)止血，清脾热”，《中华藏本草》[6]记载“清血热、心热、肝热、脾热及新旧热、利水、止血、止咳”。已有报道其他麻黄属植物挥发性成分，例如，甘肃草麻黄(Ephedrasinica)挥发性主要成分为d-α-松油醇(21.4%)、十六烷酸(14.74%)、9-十六炔酸(7.51%)[7]；陕西草麻黄挥发性主要成分是l-α-萜品烯醇(28.57%)、2,3,5,6-四甲基吡嗪(7.92%)[8]；中麻黄(Ephedraintermedia)挥发性主要成分为1,4-桉叶素(12.8%)、1,8-桉叶素(9.9%)；木贼麻黄(Ephedraequisetina)的挥发性主要成分是十六烷酸(26.22%)、邻苯二甲酸二丁酯(10.48%)[9]。藏麻黄因长期适应于高原环境，可能有特殊的药效物质。已发现藏麻黄根、茎具有的特殊香气有别于中药草麻黄、中麻黄等。其挥发性成分是什么，与其他麻黄属植物挥发性成分有何区别，麻黄根与茎的挥发性成分有何区别，目前未见报道。

利用网络药理学方法筛选活性物质，预测靶标蛋白，寻找信号通路，可快速预测活性成分、靶标蛋白和疾病发生发展相关通路网络之间的相互作用。分子对接是一种运用计算机技术基于受体特性以及受体与药物分子之间相互作用方式的药物设计方法，其主要研究依据是配体和受体分子在结合过程中的构象变化。由于在线的TCMSP数据库中未包括藏麻黄化学成分信息，因此，利用GC-MS推测藏麻黄挥发性成分，结合TCMSP在线数据构建小型数据库，利用化合物CAS号查询潜在的药物作用靶点，实施网络药理学分析与分子对接，预测藏麻黄挥发性成分治疗支气管炎的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

气质联用仪(GC-MS)(6890N+5975B，美国Agilent公司)，挥发油提取器(常规玻璃仪器)。本研究所用的藏麻黄采自西藏拉萨，海拔3 674 m，经西藏大学拉琼教授鉴定为藏麻黄(E.saxatilis)；所用试剂有乙醚(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)、无水硫酸钠(分析纯，成都金山化学试剂有限公司)。

1.2 数据库平台

中药系统药理学分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)；Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)；GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)；STRING数据库(http://string-db.org/)；Cytoscape 3.8.0软件；R 4.0.5软件及ClusterProfiler软件包；PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；蛋白质晶体数据库PDB(http://www.rcsb.org)；CB-Dock分子对接在线平台(http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php)。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS分析

1.3.1.1 挥发油制备

采用传统水蒸气蒸馏法分别提取藏麻黄根、茎的挥发油。称取粉碎后的样品200 g于提取器中，加适量水浸泡1 h，加热提取6 h，冷却至室温后加适量乙醚萃取，待均匀分层后取出乙醚层，经无水硫酸钠干燥，乙醚自然挥干，得到具有特殊香味的淡黄色油状物。

1.3.1.2 GC-MS条件

美国Agilent公司6890N/5975B型气相色谱-质谱联用仪，GC条件：HP-5MS型色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升温：柱初始温度60 ℃，保温2 min，以5 ℃/min升温速率升至250 ℃，保温10 min；载气He；流速1 mL/min；分流比100∶1。

MS条件：EI离子源；电子能量70 eV；离子源温度260 ℃；扫描范围30～500 aum；接口温度250 ℃；四级杆温度150 ℃；溶剂延迟3 min；进样量1 μL。

检索数据库为NIST14，采用峰面积归一化法计算挥发油各成分的相对百分含量。

1.3.2 网络药理学分析

1.3.2.1 检索化合物潜在的靶点与支气管炎相关靶点

利用GC-MS检测出的藏麻黄挥发油化合物的CAS号在中药系统药理学分析平台(TCMSP)获得化合物的MOLID及其潜在的作用靶点及相关基因名。检索得到的靶点再与Uniprot数据库比对，通过Uniprot进行gene名称标准化。在GeneCards数据库以“Bronchitis”为检索词搜索支气管炎相关靶点的gene名称，将化合物靶点和疾病相关靶点取交集分析。用上述靶点信息可分析藏麻黄挥发油对支气管炎的治疗机制。

1.3.2.2 靶标蛋白互相作用核心网络的构建

将所得的共同靶基因在STRING数据库进行PPI网络分析，隐藏游离靶点，蛋白互作分值设为0.4，导出TSV格式文件，导入Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白互作网络。

1.3.2.3 化合物-靶点-通路网络

利用Cytoscape 3.7.1软件对化合物、靶点、通路信息进行化合物-靶点-通路网络的构建。

1.3.2.4 靶点通路分析

将靶点通过R语言ClusterProfiler包进行GO功能富集分析，对得到的生物过程(biological process，BP)条目、细胞组成(cell composition，CC)条目、分子功能(molecular function，MF)条目以P<0.05加以筛选，各类别排名前10的GO条目绘制气泡图，KEGG通路富集筛选得到的前20条信号通路(P<0.05)绘制气泡图。

1.3.3 分子对接

在使用Cytoscape 3.7.1构建蛋白互作网络时对数据进行“Network Analyze”分析，根据分析结果选择degree值靠前的4个靶点作为分子对接的蛋白。在化合物-靶点-通路网络构建时对该网络也进行“Network Analyze”拓扑分析，选取degree值大于10的化合物与上述靶点分别进行分子对接。分别从PDB和PubChem数据库下载上述筛选出的核心成分以及核心靶点的蛋白质晶体结构和化合物结构文件，利用CB-Dock网络平台对靶点与化合物进行对接。

2 结果

2.1 GC-MS检测及结果

根据“1.3.1.2”方法对藏麻黄根、茎的挥发油进行分析，共检出146个化合物(见图1、图2)。根据NIST14匹配度和RI指数，推测了67个化合物(见表1)，其中茎的挥发油中含有40个化合物，占藏麻黄茎总挥发性成分的67.91%。根挥发油中共推测了38个化合物，占藏麻黄根总挥发性成分的61.43%。藏麻黄茎中挥发油主要化合物是2,3,5,6-四甲基吡嗪(10.92%)、Z-9-十五烯醇(9.15%)、二羟基苯乙酮(7.92%)；藏麻黄根挥发油中主要化合物为亚油酸(7.81%)、红没药醇(7.1%)、Z-9-十五烯醇(5.98%)。根、茎共有挥发性成分有12个，分别为苯甲醛、α-萜品醇、芳樟醇氧化物、2,3,5,6-四甲基吡嗪、香叶醇、百里香酚、α-香柠檬烯、榄香醇、Z-9-十五烯醇、棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸。

图1 藏麻黄根挥发性成分总离子流图Fig.1 TIC of the volatile chemical compounds in E.saxatilis roots

图2 藏麻黄茎挥发性成分总离子流图Fig.2 TIC of the volatile chemical compounds in E.saxatilis stems

表1 藏麻黄根、茎挥发性化学成分

续表1(Continued Tab.1)

2.2 化合物潜在作用靶点与支气管炎相关靶点

藏麻黄根、茎的67个挥发性成分，命中362个靶点，去重后34个化合物命中94个靶点。通过对94个靶点与GeneCards数据库获得的1 125个支气管炎疾病靶点做韦恩交集处理，得到32个化合物与疾病的公共靶点(见图3)。

图3 化合物、疾病靶点交集韦恩图Fig.3 Venny diagram between chemical targets and disease targets

2.3 靶标蛋白互相作用核心网络

上述34个化合物与支气管炎疾病的32个公共靶点导入STRING数据库进行PPI网络分析，获得化合物靶标蛋白互作核心网络数据。为了更直观表示蛋白互作核心网络关系，该数据用Cytoscape 3.7.1软件构建蛋白互作网络图(见图4)。隐藏游离节点，该网络共有30个节点，178条边。结果发现白细胞介素6(IL6)、肿瘤坏死因子(TNF)、前列腺素内过氧化物合成酶2(PTGS2)、白细胞介素8(CXCL8)这4个靶点可能是藏麻黄挥发性成分治疗支气管炎的关键靶点。

图4 化合物靶标蛋白互作核心网络Fig.4 Core network of compound target protein interaction注：节点表示蛋白，每条边则表示蛋白与蛋白之间的相互作用关系。节点越大或条越粗表示关联度越大。颜色随着蛋白互作关联度的减小呈现出由蓝色到黄色再到橙色的渐变过程。Note:Nodes represent proteins,and each edge represent the protein-protein interaction relationship.Larger nodes or thicker bars represent a greater degree of association.The color gradually changed from blue to yellow,to orange shows the decreases the protein-interaction association.

2.4 GO分析和KEGG通路分析

用“1.3.2.4”方法对藏麻黄挥发性成分与支气管炎的32个交集靶点做GO和KEGG富集分析。GO富集分析结果发现有173个生物过程(BP)、19个细胞组成(CC)、29个分子功能(MF)条目(见图5)。结果上述32个靶点主要富集在脂多糖的响应、细菌源分子的响应、氧化应激反应、对毒性物质的反应及细胞对脂多糖的反应等生物过程；在细胞组成方面，主要富集在膜筏、膜微域、膜区域、浆膜外腔等；在分子功能方面体现在细胞因子受体结合、细胞因子活性、热休克蛋白结合、蛋白酶结合等。

图5 GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis注：圆点大小表示富集的基因数，圆点越大富集基因越多；颜色代表富集的显著程度，颜色越红富集越显著。下同。Note:The circular dot size indicates the number of enrichment genes.The circular dot size larger,the number of genes increase.The color indicates the significance of enrichment.The more significant enrichment,the color to be redder.The same below.

KEGG富集分析结果得到55个通路，其中对前20条通路(P<0.05)进行可视化分析，结果(见图6)显示藏麻黄挥发性成分的靶点主要富集在乙型肝炎、脂质和动脉粥样硬化、沙门氏菌感染、Toll样受体信号通路等。IL6、TNF、PTGS2、CXCL8蛋白共同参与了Toll样受体、阿米巴病、军团菌病、恰加斯病(美洲锥虫病)、百日咳、乙型肝炎、类风湿性关节炎、疟疾等信号通路。

图6 KEGG前20个通路富集分析Fig.6 The top 20 of KEGG pathway enrichment analysis

2.5 化合物-靶点-通路网络

32个公共靶点、KEGG前20条通路(P<0.05)与对应公共靶点的21个化合物用Cytoscape软件进行“Network Analyze”分析，获得化合物-靶点-通路网络关系图。发现共有73个节点，209条边(见图7)。藏麻黄根、茎挥发性成分中丁子香酚(degree=28)、月桂酸(degree=17)、反式法尼醇(degree=17)、α-萜品醇(degree=13)、榄香醇(degree=12)、棕榈酸(degree=12)为作用于支气管炎疾病靶点的主要有效成分。

图7 化合物、靶点和通路相互作用网络图Fig.7 The network of compounds interaction with targets and pathway注：红色节点代表化合物，黄色节点代表靶点，蓝色节点代表作用通路。Note:The red color nodes represent compounds,the yellow nodes represent targets,and the blue nodes represent pathways.

2.6 分子对接分析

用“1.3.3方法”将“2.3分析结果”中的4个靶点蛋白和“2.5分析结果”中的6个化合物进行分子对接。根据靶点与配体之间的结合能用Vina分值评价，得分小于0说明蛋白和化合物可以结合，得分越低靶点与配体之间结合越容易。对接结果(见表2)显示藏麻黄挥发性成分丁子香酚、月桂酸、反式法尼醇、α-萜品醇、榄香醇、棕榈酸与IL6、TNF、PTGS2、CXCL8这4个靶点具有良好的结合作用。图8为对接效果较好的反式法尼醇、榄香醇、棕榈酸、丁子香酚与PTGS2之间的分子对接示例。

表2 核心靶点与化合物的对接数值

续表2(Continued Tab.2)

3 讨论与结论

本研究发现了藏麻黄茎中挥发性主要成分与中麻黄和木贼麻黄中已报道的挥发性主要成分不同。2,3,5,6-四甲基吡嗪为藏麻黄与草麻黄共有的挥发性主要成分。除了麻黄碱及伪麻黄碱以外，2,3,5,6-四甲基吡嗪亦是麻黄的主要活性成分，在食品香料添加剂中应用较广。藏麻黄茎的其他两个主要成分为Z-9-十五烯醇(9.15%)和二羟基苯乙酮(7.92%)。Z-9-十五烯醇被报道为白花前胡(Peucedanumpraeruptorum)茎挥发性主要成分，其挥发油具有对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和福氏志贺氏菌有抑菌活性[10]，但是Z-9-十五烯醇物质是否具有活性未报道。二羟基苯乙酮对慢性阻塞性肺疾病患者有降低平均肺动脉压作用[11]，但对支气管炎作用方面未报道。藏麻黄根挥发性主要成分为亚油酸(7.81%)、红没药醇(7.1%)、Z-9-十五烯醇(5.98%)。亚油酸为不饱和脂肪酸，有降低血脂、软化血管的作用。红没药醇是西藏扁芒菊(Waldheimiaglabra)、刺蕊草属植物(Pogostemonspeciosus)、巴西菊属植物(Eremanthuserythropappus)和母菊(Matricariachamomilla)等植物中含有的主要成分，有抗炎、抗癌、抗菌和抗氧化等活性[12]。藏麻黄根、茎共有挥发性成分中棕榈油酸、棕榈酸、亚油酸都属于不饱和脂肪酸，有重要的营养价值和经济价值。α-萜品醇、芳樟醇氧化物、α-香柠檬烯、百里香酚、榄香醇也是植物挥发油中常见的成分，有抑菌、抗炎和抗氧化等多个活性。综合以上，说明藏麻黄根茎挥发油在食品、药物开发等具有应用前景。

支气管炎多为散发性疾病，流行倾向较小，发病时间多为寒冷季节或气候突变之时，年老体弱者易发。临床验证[13]表明麻黄治疗急性支气管炎、小儿毛细支气管炎效果显著。支气管炎是炎症反应机制的疾病，本研究筛选出IL6、TNF、PTGS2、CXCL8等4个核心靶蛋白，可能在藏麻黄挥发性成分治疗支气管炎的过程中起重要作用。IL-6是一种具有多种生物活性的趋化因子，可刺激多种疾病的炎症和自身免疫过程，具有激活和调节免疫细胞等生理特性，通过参与淋巴细胞和单核细胞的分化，促进B细胞的成熟，分泌IgG、IgE、IgA等细胞因子，从而参与多种炎症反应及疾病的发生发展过程[14]，是治疗感染、炎症、自身免疫和癌症的药物靶标。TNF是一种涉及系统性炎症的细胞因子，同时也是属于引起急性反应的众多细胞因子中的一员，主要由巨噬细胞分泌，可诱发某些肿瘤细胞系的细胞死亡。TNF-α可以激活中性粒细胞和巨噬细胞，以增加其细胞毒性作用，释放更多IL-6、IL-8等细胞炎性因子，进而加快炎症反应进程[15]。PTGS2负责产生炎性前列腺素，是诱导生物活性的脂类调节物，在炎症介质的刺激下，其水平显著升高，且哮喘患者支气管肺泡灌洗液中的PTGS2含量较多，表明PTGS2与哮喘的炎症相关[16]。CXCL8是巨噬细胞和上皮细胞等分泌的细胞因子，能吸引中性粒细胞、嗜碱细胞和T细胞，还参与中性粒细胞的激活。它可从几种类型的细胞中释放出来，以应对炎症的刺激，其主要生物活性是吸引和激活中性粒细胞，中性粒细胞与CXCL8接触后发生形态变化，定向游走到反应部位并释放一系列活性产物，这些作用可导致机体局部的炎症反应，达到杀菌和细胞损伤的目的。此外CXCL8对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞也有一定作用。

本研究发现了藏麻黄34个挥发性成分作用于支气管炎32个靶点。这些靶点中包括了茎的主要成分2,3,5,6-四甲基吡嗪，根的主要成分亚油酸和根茎共有的成分苯甲醛、α-萜品醇、芳樟醇氧化物、2,3,5,6-四甲基吡嗪、香叶醇、百里香酚、榄香醇。与IL6、TNF、PTGS2、CXCL8具有良好结合作用的靶点有丁子香酚、月桂酸、反式法尼醇、α-萜品醇、榄香醇和棕榈酸。其中丁子香酚和月桂酸是根的成分，反式法尼醇是茎的成分，α-萜品醇、榄香醇和棕榈酸是根茎共有成分。由此可见，藏麻黄根和茎挥发油都对治疗支气管炎可能有作用。丁子香酚被认为是植物源农药，具有杀菌作用。月桂酸有提高抗炎因子IL-10、降低促炎因子IL-6表达的作用，在一定程度上可以缓解机体的炎症反应[17]。法尼醇有抑制变形链球菌(Streptococcusmutans)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)和放线菌(Actinomycesnaeslundii)的作用，高浓度法尼醇抑制小鼠白念感染中1L-17的表达。α-萜品醇存在于植物挥发油中，有抑菌、抗氧化和抗炎作用，其酯类化合物有驱虫作用。上述3个物质都有抑制炎症因子的作用，但是棕榈酸被报道有促炎作用[18]。丁子香酚和榄香醇都是植物精油中常见的物质，与精油中的其他成分一起被报道其抑菌效果显著[19]。由此表明月桂酸、反式法尼醇、α-萜品醇、丁子香酚和榄香醇可能通过抑菌作用参与炎症反应。GO富集结果也显示上述化合物的靶点显著富集在细菌源分子的响应过程。四个靶标分子共同富集在Toll-样受体信号通路中。Toll样受体属于固有免疫病源模式识别受体，可识别入侵病原微生物，在炎症、免疫细胞调控等方面起关键作用。由此表明藏麻黄根茎挥发油中丁子香酚、月桂酸、反式法尼醇、α-萜品醇、榄香醇可能通过抑制TNF、IL-17、Toll-样受体等炎症与免疫信号通路中IL6、TNF、PTGS2、CXCL8的表达，抑制炎症与病原微生物免疫反应，从而起到治疗支气管炎的作用。而棕榈酸引起促炎因子的分泌，导致机体的炎症反应。

本研究基于网络药理学及分子对接的方法以藏麻黄根、茎挥发性成分为研究对象，综合分析其干预支气管炎的生物学途径及通路，并用反向分子对接进行验证，得出活性成分干预支气管炎主要呈现多分子、多靶点、多通路的特点，且各挥发性成分间存在协同效应。研究结果为藏麻黄的实验研究和临床应用提供参考，但本研究结果仅是通过理论推测藏麻黄挥发性成分与支气管炎作用的机制，还需再进行药理实验才能进一步验证。