于 淼，冉红玲，梅文莉，黄圣卓，魏艳梅，蔡彩虹，戴好富，王 昊*

1中国热带农业科学院热带生物技术研究所 海南省黎药资源天然产物研究与利用重点实验室；2海南热带农业资源研究院 海南省热带农业生物资源保护与利用重点实验室，海口571101

羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)又名羊角扭、鲤鱼橄榄、山羊角，为夹竹桃科(Apocynaceae)羊角拗属(Strophanthus)植物，主要分布在我国海南、云南、贵州、广东和福建等省份，老挝、越南等南亚国家也有分布，野生于丘陵山地、路旁疏林中或山坡灌木丛中[1]。羊角拗全株植物含毒，为药用强心剂，可用于治疗血管硬化、跌打扭伤、风湿性关节炎、蛇咬伤等症，也可在农业上用作杀虫剂[1]。研究表明羊角拗主要含有强心苷[2-4]，也含有倍半萜、三萜和木脂素等化学成分[5]，羊角拗的提取物具有强心、抗菌、抗氧化和杀虫等作用[6-8]，强心苷类化合物具有抗肿瘤、强心等生物活性[9,10]。为了进一步完善羊角拗化学物质基础研究，深入挖掘该植物的化学成分及其抗炎活性，本研究采用硅胶、Sephadex LH-20凝胶等多种色谱分离技术对羊角拗茎乙醇提取物的乙酸乙酯萃取物分离研究，并采用LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7体外细胞炎症模型对其化学成分进行体外抗炎活性测试。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Bruker AV-500型超导核磁共振波谱仪(德国Bruker公司)；Autospec 300质谱仪(英国VG公司)；分析型高效液相色谱仪(Agilent 1260)(美国安捷伦科技有限公司)；旋转蒸发仪(Heidolph Laborota)；ELX-800酶标仪(美国宝特公司)；ZHJH-C1109C超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)；HHB11360-S CO2培养箱(上海跃进医疗器械厂)；Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(德国Merck公司)；柱层析硅胶G(200～300目，60～80目)、薄层层析硅胶H(青岛海洋化工厂)；氘代试剂(青岛腾龙微波科技有限公司)；常用有机试剂为国产AR级试剂(天津市康科德科技有限公司)；色谱纯甲醇和乙腈(天津市科密欧有限公司)；水为超纯水；浓硫酸(山东淄博滨岭化工有限公司)；RAW 264.7细胞株(购于中科院干细胞库)；洁特96孔细胞培养板(TCP011096)(广州洁特生物过滤股份有限公司)；磷酸缓冲液PBS、DMEM 高糖培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司，批号21010702)；青链霉素混合液(北京Solarbio公司)；胰蛋白酶(美国 Amresco公司)；脂多糖(LPS)、Griess试剂、槲皮素和四甲基偶氮唑蓝(美国Sigma公司)。

1.2 材料

羊角拗茎于2019年9月采自海南省海口市，并经中国热带农业科学院热带生物技术研究所黄圣卓博士鉴定为夹竹桃科(Apocynaceae)羊角拗属(Strophanthus)植物羊角拗(Strophanthusdivaricatus(Lour.) Hook.et Arn.)，凭证标本(WANG202002)保存于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.3 实验方法

1.3.1 提取与分离

羊角拗茎(24.4 kg)，干燥粉碎后用95%乙醇浸泡提取3次，提取液减压浓缩得到乙醇提取物(1.5 kg)。将提取物分散于水中成悬浊液，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，得到石油醚萃取物(256.0 g)、乙酸乙酯萃取物(328.1 g)和正丁醇萃取物(438.0 g)。乙酸乙酯萃取物经正相硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脱，洗脱液经薄层层析分析后，合并得流分A～H。在HPLC-UV的指导下，F经减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)、丙酮梯度洗脱，得到12个流分(F1～F12)。F6经减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(5∶1→0∶1)多次梯度洗脱后，通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)分离得到化合物2(4.6 mg)、3(4.5 mg)、8(1.3 mg)、9(4.8 mg)和10(2.1 mg)。 F7经减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(10∶1→0∶1)梯度洗脱后，通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)分离，再经多次硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯(5∶1)洗脱得到化合物4(3.1 mg)、6(3.8 mg)和7(1.0 mg)。F8经减压硅胶柱色谱，以石油醚-乙酸乙酯(6∶1→0∶1)梯度洗脱后，通过Sephadex LH-20凝胶柱色谱(甲醇)分离，得到化合物11(2.0 mg)、12(10.5 mg)和13(4.1 mg)，未纯化部分再经多次硅胶柱层析以石油醚-乙酸乙酯(4∶1)洗脱后，通过制备薄层色谱得到化合物5(4.1 mg)。F10在甲醇中重结晶得到化合物1(115.0 mg)。

1.3.2 抗炎活性

采用脂多糖(LPS)诱导小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7模型对化合物1～13进行抗炎活性筛选[11,12]。实验分为阳性对照组(槲皮素)、LPS诱导组、空白对照组和不同浓度的样品组，并将待测样品梯度稀释为5个浓度：100、50、25、12.5、6.25 μM。RAW 264.7细胞复苏后，采用含10%胎牛血清、1%的青霉素-链霉素双抗的DMEM培养液，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。选取对数生长期的RAW 264.7细胞，取100 μL细胞液以5×104个/mL密度接种于96孔板上，于37 ℃、5% CO2、90%以上湿度条件下培养24 h，再分别加入50 μL配制的LPS (终浓度0.5 μg/mL)和50 μL待测化合物溶液(100～6.25 μM)。继续培养24 h后每孔取100 μL上清液于新的96孔板中，之后在每孔中加入100 μL的Griess试剂，于酶标仪540 nm处测定并记录吸光度A，根据公式(1)计算出NO的抑制率，通过绘制化合物浓度-抑制率曲线图，计算化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞产生NO的半抑制浓度。

抑制率=(C2-C1)/(C2-C0)×100%

(1)

式中：C0、C1、C2分别为540 nm下测得的空白对照组、不同浓度的样品组、LPS组的吸光度。

1.3.3 数据处理

用SPSS 25.0对实验数据进行单因素方差分析，表中数据均用平均值±标准误差表示。当P<0.05时，认为具有统计学显著性差异。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1无色针状晶体(甲醇)；C30H48O4，ESI-MS：m/z473.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：12.03(1H，s，28-OH)，5.16(1H，m，H-12)，4.40(1H，t，J= 4.1 Hz，23-OH)，4.16(1H，d，J= 4.9 Hz，3-OH)，3.42(1H，m，H-3)，3.31(1H，m，H-23a)，3.07(1H，dd，J= 10.5，4.1 Hz，H-23b)，2.74(1H，dd，J= 13.5，4.1 Hz，H-18)，1.09(3H，s，27-CH3)，0.86(3H，s，25-CH3)，0.86(3H，s，29-CH3)，0.86(3H，s，30-CH3)，0.71(3H，s，26-CH3)，0.52(3H，s，24-CH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：37.9(C-1)，26.6(C-2)，70.3(C-3)，41.4(C-4)，47.1(C-5)，17.5(C-6)，32.1(C-7)，38.8(C-8)，46.4(C-9)，36.3(C-10)，22.6(C-11)，121.6(C-12)，143.9(C-13)，41.9(C-14)，27.2(C-15)，22.9(C-16)，45.5(C-17)，40.8(C-18)，45.7(C-19)，30.4(C-20)，33.3(C-21)，30.2(C-22)，64.5(C-23)，12.7(C-24)，15.5(C-25)，16.9(C-26)，25.7(C-27)，178.6(C-28)，32.9(C-29)，23.4(C-30)。以上数据与文献[13]报道对照基本一致，故鉴定化合物1为常春藤皂苷元(结构见图1)。

图1 羊角拗茎中化合物1～13的结构Fig.1 The structures of compounds 1-13 from the stems of S.divaricatus

化合物2黄色油状；C11H16O3，ESI-MS：m/z197.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：5.75(1H，s，H-2)，4.22(1H，m，H-6)，2.42(1H，m，H-7a)，1.99(1H，m，H-5a)，1.74(1H，d，J= 4.0 Hz，H-7b)，1.53(1H，dd，J= 14.4，4.0 Hz，H-5b)，1.76(3H，s，H-10)，1.47(3H，s，H-11)，1.28(3H，s，H-9)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：174.4(C-1)，113.3(C-2)，185.7(C-3)，37.2(C-4)，47.9(C-5)，67.3(C-6)，46.4(C-7)，88.9(C-8)，31.0(C-9)，27.4(C-10)，26.9(C-11)。以上数据与文献[14]报道对照基本一致，故鉴定化合物2为(-)-loliolide。

化合物3黄色油状；C13H22O4，ESI-MS：m/z243.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.17(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7)，6.18(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，3.75(1H，m，H-3)，2.30(1H，d，J= 5.2 Hz，H-4a)，1.65(1H，dd，J= 9.1，5.2 Hz，H-4b)，1.57(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2a)，1.26(1H，d，J= 11.9 Hz，H-2b)，2.28(3H，s，H-10)，1.19(3H，s，H-12)，1.18(3H，s，H-13)，0.96(3H，s，H-11)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：36.1(C-1)，47.6(C-2)，64.3(C-3)，41.3(C-4)，68.7(C-5)，70.8(C-6)，145.5(C-7)，133.8(C-8)，200.3(C-9)，27.5(C-10)，25.2(C-11)，29.8(C-12)，20.1(C-13)。以上数据与文献[15]报道对照基本一致，故鉴定化合物3为(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物4黄色油状；C13H20O2，ESI-MS：m/z209.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.75(1H，dd，J= 15.7，9.5 Hz，H-7)，6.11(1H，d，J= 15.7 Hz，H-8)，5.55(1H，br s，H-4)，4.15(1H，m，H-3)，2.34(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，1.60(1H，dd，J= 12.9，6.7 Hz，H-2a)，1.43(1H，dd，J= 12.9，9.5 Hz，H-2b)，2.25(3H，s，H-11)，1.62(3H，s，H-13)，0.97(3H，s，H-12)，0.88(3H，s，H-10)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：35.9(C-1)，41.0(C-2)，66.9(C-3)，127.7(C-4)，136.1(C-5)，55.5(C-6)，150.3(C-7)，133.4(C-8)，201.0(C-9)，29.6(C-10)，27.2(C-11)，27.0(C-12)，22.6(C-13)。以上数据与文献[16]报道对照基本一致，故鉴定化合物4为(3R,6R,7E)-3-hydroxy-4,7-megastigmadien-9-one。

化合物5白色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：6.94(2H，d，J= 1.7 Hz，H-2，H-2′)，6.80(2H，dd，J= 8.1，1.8 Hz，H-6，H-6′)，6.76(2H，d，J= 8.1 Hz，H-5，H-5′)，4.70(2H，d，J= 4.4 Hz，H-7，H-7′)，4.22(2H，m，H-9a，H-9a′)，3.82(2H，m，H-9b，H-9b′)，3.13(2H，m，H-8，H-8′)，3.84(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.8(C-1，C-1′)，111.0(C-2，C-2′)，149.1(C-3，C-3′)，147.3(C-4，C-4′)，116.1(C-5，C-5′)，120.1(C-6，C-6′)，87.5(C-7，C-7′)，55.4(C-8，C-8′)，72.6(C-9，C-9′)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上数据与文献[17]报道对照基本一致，故鉴定化合物5为松脂素。

化合物6黄色粉末；C20H22O6，ESI-MS：m/z359.3 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：6.96(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2)，6.91(1H，d，J= 1.5 Hz，H-2′)，6.89(1H，m，H-5)，6.89(1H，m，H-5′)，6.84(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6)，6.79(1H，dd，J= 8.1，1.5 Hz，H-6′)，4.86(1H，d，J= 5.3 Hz，H-7′)，4.43(1H，d，J= 7.1 Hz，H-7)，4.12(1H，d，J= 9.5 Hz，H-9a)，3.85(1H，m，H-9b)，3.85(1H，m，H-9a′)，3.33(1H，m，H-8′)，3.33(1H，m，H-9b′)，2.91(1H，dd，J= 14.8，7.0 Hz，H-8)，3.92(3H，s，5-OCH3)，3.90(3H，s，5′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：133.2(C-1)，108.7(C-2)，146.9(C-3)，145.5(C-4)，114.4(C-5)，119.3(C-6)，87.9(C-7)，54.6(C-8)，71.1(C-9)，130.5(C-1′)，108.5(C-2′)，146.6(C-3′)，144.7(C-4′)，114.4(C-5′)，118.6(C-6′)，82.2(C-7′)，50.3(C-8′)，69.8(C-9′)，56.1(5-OCH3)，56.1(5′-OCH3)。以上数据与文献[18]报道对照基本一致，故鉴定化合物6为表松脂素。

化合物7黄色粉末；C15H14O5，ESI-MS：m/z275.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.51(2H，d，J= 1.9 Hz，H-2，H-2′)，7.36(2H，dd，J= 8.3，1.9 Hz，H-6，H-6′)，6.89(2H，d，J= 8.3 Hz，H-5，H-5′)，3.94(6H，s，3-OCH3，3′-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：126.5(C-1，C-1′)，111.9(C-2，C-2′)，149.7(C-3，C-3′)，155.4(C-4，C-4′)，116.3(C-5，C-5′)，127.7(C-6，C-6′)，195.6(C-7)，56.4(3-OCH3，3′-OCH3)。以上数据与文献[19]报道对照基本一致，故鉴定化合物7为4,4′-dihydroxy-3,3′-dimethoxybenzophen-one。

化合物8黄色粉末；C15H12O6，ESI-MS：m/z289.2 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.31(2H，d，J= 8.4 Hz，H-2′，H-6′)，6.81(2H，d，J= 8.4 Hz，H-3′，H-5′)，5.88(1H，s，H-8)，5.33(1H，dd，J= 12.9，3.0 Hz，H-2)，3.11(1H，dd，J= 17.1，12.9 Hz，H-3a)，2.69(1H，dd，J= 17.1，3.0 Hz，H-3b)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：80.5(C-2)，44.1(C-3)，197.8(C-4)，159.0(C-5)，131.3(C-6)，164.9(C-7)，96.2(C-8)，165.4(C-9)，103.3(C-10)，131.1(C-1′)，129.0(C-2′)，116.3(C-3′)，165.5(C-4′)，116.3(C-5′)，129.0(C-6′)。以上数据与文献[20]报道对照基本一致，故鉴定化合物8为6-羟基柚皮素。

化合物9黄色油状；C10H8O4，ESI-MS：m/z193.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.90(1H，d，J= 9.4 Hz，H-4)，7.20(1H，s，H-5)，6.77(1H，s，H-8)，6.31(1H，d，J= 9.4 Hz，H-3)，3.81(3H，s，6-OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：160.7(C-2)，111.7(C-3)，144.5(C-4)，109.6(C-5)，145.3(C-6)，149.5(C-7)，102.8(C-8)，151.2(C-9)，110.6(C-10)，56.0(6-OCH3)。以上数据与文献[21]报道对照基本一致，故鉴定化合物9为东莨菪素。

化合物10棕色粉末；C11H10O5，ESI-MS：m/z223.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.88(1H，d，J= 9.5 Hz，H-4)，6.75(1H，s，H-6)，6.35(1H，d，J= 9.5 Hz，H-3)，3.92(3H，s，8-OCH3)，3.91(3H，s，7-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：163.1(C-2)，115.3(C-3)，146.3(C-4)，101.0(C-5)，141.7(C-6)，151.7(C-7)，140.0(C-8)，139.8(C-9)，116.0(C-10)，56.6(7-OCH3)，61.4(8-OCH3)。以上数据与文献[22]报道对照基本一致，故鉴定化合物10为6-羟基-7,8 -二甲氧基香豆素。

化合物11棕色粉末；C7H6N2，ESI-MS：m/z119.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：8.06(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)，7.93(1H，s，H-3)，7.42(1H，d，J= 8.2 Hz，H-7)，7.17(1H，m，H-4)，7.16(1H，m，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：132.7(C-3)，121.9(C-4)，121.8(C-5)，127.2(C-6)，112.5(C-7)，137.6(C-8)，121.3(C-9)。以上数据与文献[23]报道对照基本一致，故鉴定化合物11为吲唑。

化合物12黄色粉末；C8H8O4，ESI-MS：m/z169.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.57(1H，overlapped，H-2)，7.57(1H，overlapped，H-6)，6.85(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5)，3.91(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：123.4(C-1)，114.1(C-2)，149.0(C-3)，153.0(C-4)，116.1(C-5)，125.6(C-6)，56.7(3-OCH3)，170.3(1-COOH)。以上数据与文献[24]报道对照基本一致，故鉴定化合物12为香草酸。

化合物13白色粉末；C7H6O3，ESI-MS：m/z139.1 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.89(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，H-6)，6.84(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，H-5)；13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：122.7(C-1)，133.0(C-2，C-6)，116.0(C-3，C-5)，163.3(C-4)，170.1(1-COOH)。以上数据与文献[25]报道对照基本一致，故鉴定化合物13为对羟基苯甲酸。

2.2 抗炎活性结果

化合物1～13的抗炎活性结果表明，仅化合物5能够显著抑制LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7产生NO，IC50值为18.09 ± 1.09 μM，略弱于阳性对照槲皮素(11.54±0.23 μM)。其他化合物未显示明显抗炎活性(见表1)。

表1 化合物1～13的对LPS诱导RAW 264.7细胞产生NO的半数抑制浓度(n = 3)

3 结论

本研究首次从羊角拗茎中分离鉴定13个化合物(1～4和6～13)，其中文献报道五环三萜常春藤皂苷元(1)具有抗肿瘤、抗抑郁和抗菌等活性[26]，有待进一步研究。采用LPS诱导小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7模型的抗炎活性筛选结果表明，松脂素(5)具有显著的抗炎活性，IC50值为18.09±1.09 μM。本研究丰富了羊角拗的化合物类型，也为其抗炎活性研究提供了依据。