王昱 张春盼 王艳 刘立伟 李轲鑫 马子坤 贾继东 王伽伯 赵新颜

作为一种传统的滋补中药，制何首乌具有降血脂及抗动脉粥样硬化、抗氧化及抗衰老、保肝、抗骨质疏松、抗炎、增强免疫、抗肿瘤等药理作用，在国内乃至世界范围内广泛使用[1]。近年来何首乌导致的肝损伤(polygonum multiflorum-associated drug induce liver injury, PM-DILI)在全球范围内逐渐升高，成为国内外关注的热点问题[2-5]。PM-DILI常见于30～60岁的患者，临床表现主要为黄疸、纳差、乏力、腹胀、恶心及呕吐，病理表现以急性肝炎及急性淤胆性肝炎为主[6]。同时，PM-DILI病例好发于银屑病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等免疫功能紊乱的患者[7]。何首乌引起的肝损伤与免疫状态有关，而与性别、服药剂量无显著相关，具有不可预测性，符合特异体质性药物性肝损伤的特征(Idiosyncratic drug-induced liver injury,iDILI)[8]。

为了减少PM-DILI的发病率，宋海波和沈传勇[9]提出了何首乌的合理用药和安全防控的建议。研究表明，不同的炮制方法可减轻何首乌的毒性，炮制后的何首乌能够降低其特异质肝损伤相关的易感成分：顺式二苯乙烯苷和大黄素葡萄糖苷，而这两种物质是何首乌致特异质肝损伤的主要成分[10-17]。

目前认为PM-DILI具有特异质肝损伤的特征，且与机体的免疫状态密切相关[18]。为此本研究采用基于免疫耐受缺陷的特异质肝损伤动物模型观察制何首乌的作用，从而更好地理解何首乌对肝脏的作用规律。然而，研究结果与预想的方向截然不同，未观察到制何首乌对免疫耐受缺陷小鼠引起特异质肝损伤，而观察到制何首乌改善了模型小鼠的肝脏组织病理损伤，现报道如下。

资料与方法

一、实验材料

SPF级C57BL/6品系的PD-1-/-小鼠10只，体质量为(18±2)g，购自上海南方模式生物科技股份有限公司。所有小鼠均在首都医科大学附属北京友谊医院动物实验中心SPF级动物房饲养。本研究经首都医科大学附属北京友谊医院动物伦理委员会批准(19-2023)。

CTLA-4抗体(Bio X Cell, West Lebanon, 美国)。制何首乌配方颗粒购于首都医科大学附属北京市中医医院，经液相质谱联用仪检测，结果表明该批次制何首乌未检测出主要易感成分顺式二苯乙烯苷，另一个易感成分大黄素葡萄糖苷的含量低于前期文献报道的安全限度[17]。Premix Taq(Takara Bio, Kusatsu, 日本)。免疫组织化学抗体CD3、CD4、CD8、CD38、CD68、CTLA-4(Abcam, Cambridge, 英国)。所有流式荧光抗体购自(e Bioscience, San Diego, 美国)。

二、实验方法

(一)小鼠基因鉴定 取小鼠尾尖0.5 cm置于0.6 mL EP管，加入A液(50 μL)、B液(50 μL)提取DNA，取2 μL DNA提取物加入10 μL Premix Taq、7 μL超净水、1 μL引物混匀后，进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳，Bio Rad凝胶成像。

(二)使用CTLA-4抗体联合PD-1-/-小鼠建立特异体质性肝损伤模型 将小鼠随机分为对照组和制何首乌组。使用磷酸缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)与CTLA-4抗体进行配置，两组小鼠均于药物干预前3 d、前1 d以300 μg/只进行腹腔注射，并在给药期间每周进行1次CTLA-4抗体腹腔注射[19]。制何首乌组小鼠以制何首乌溶液灌胃(制何首乌与0.9% NaCl溶液1∶1进行配制，浓度为20 g/kg)，对照组小鼠以同等剂量0.9% NaCl溶液灌胃，持续6周。

(三)动物处理 于实验第43天使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后处死，取部分肝脏组织保存于4%多聚甲醛溶液中固定, 其余肝脏进行组织解离并于酶液 (含0.01%IV型胶原酶, 0.02%BSA, 0.001%DNase I和1 mmol CaCl2)中37℃消化30 min, 经密度梯度离心去除杂质并纯化肝内非实质细胞，进行流式抗体染色及检测。

(四)血浆转氨酶水平测定 使用ALT、AST试剂盒(南京建成生物研究所)进行转氨酶水平测定。

(五)病理切片制作 肝组织经过脱水、浸蜡、石蜡包埋后制作病理切片。苏木素-伊红染色，光镜下观察肝组织形态学改变。

(六)免疫组织化学染色 根据标准免疫组织化学染色方案[20]：CD4、CD8、CD38、CD56、CD68染色。

(七)流式细胞检测 CD4+T细胞 (NK1.1-CD3+TCRb+CD4+) 、CD8+T细胞 (NK1.1-CD3+TCRb+CD8+) 、CD4+T细胞活化(NK1.1-CD3+CD4+CD69+) 、CD8+T细胞活化 (NK1.1-CD3+CD8+CD69+) 、CD8+T细胞分泌GZMB (NK1.1-CD3+CD8+GZMB+)、巨噬细胞(CD45+Ly6G-CD11bhiF4/80mid)、中性粒细胞(CD45+CD11b+Ly6G+)。

三、数据分析软件

结 果

一、动物基本状况

经基因鉴定确认所选小鼠均为纯合PD-1基因敲除小鼠。实验过程中，对照组小鼠出现倦怠、动作迟缓，制何首乌组小鼠症状显著减轻，反应灵敏且动作迅速。两组小鼠饮食无显著差异，体质量均稳定上涨，实验过程中1只制何首乌组小鼠意外死亡。对照组和制何首乌组(n=5)小鼠的ALT、AST和炎症坏死灶比较见表1。

表1 两组小鼠ALT、AST、炎症坏死灶比较

二、肝组织形态学观察

对照组肝组织可见多个大小不等的炎症坏死灶，制何首乌组肝组织仅见散在几个炎症坏死灶，炎症坏死灶数量相比对照组显著减少(图1A)。说明了使用制何首乌可以有效治疗小鼠肝损伤。

三、肝组织免疫组织化学染色

免疫组织化学染色结果提示小鼠炎症坏死灶内主要以巨噬细胞和CD4+T细胞为主(图1B、1C、1D)，与对照组相比，制何首乌组肝组织浸润的巨噬细胞、CD4+T细胞数量均减少。

注：A为小鼠肝组织HE染色；B为小鼠肝组织CD4免疫组化染色；C为小鼠肝组织CD8免疫组化染色；D为小鼠肝组织CD68免疫组化染色

四、肝组织流式细胞术检测结果

与对照组相比，制何首乌组小鼠的巨噬细胞、中性粒细胞、中性粒细胞分泌肿瘤坏死因子-α、CD4+T细胞活化(CD69+)比例、CD8+T细胞分泌GZMB比例均降低。提示制何首乌能够通过抑制巨噬细胞和中性粒细胞的募集、CD4+T细胞的活化、抑制颗粒酶B的释放以及中性粒细胞分泌TNF-α，从而阻断小鼠的肝损伤。见表2。

表2 肝组织流式细胞术检测结果(%，±s)

讨 论

近年来，药物性肝损伤(drug-induced liver injury，DILI)的检出率逐年上升且呈地域性差异，西方国家的DILI发病率为13.9～19.1/10万[21,22]，而中国DILI的发病率约为23.8/10万[23]，明显高于西方国家。有研究表明，中药是国内DILI重要的致病药物大类[24]，而在这些引起肝损伤的中药中，何首乌所占的比例位于前列。

胡锡琴等[25]发现，长期使用二苯乙烯苷会导致大鼠转氨酶水平升高，停用后可恢复。李婷婷等[14]通过使用类器官3D培养发现，在肝细胞中顺式二苯乙烯苷的毒性高于反式二苯乙烯苷。李娜等[26]研究认为，反式二苯乙烯苷在LPS易感模型中并不会引起肝损伤。本研究结果显示，与对照组小鼠相比，制何首乌组小鼠的转氨酶水平有一定程度降低、肝组织炎症坏死灶显著减少、巨噬细胞和中性粒细胞浸润显著减少。同时本研究使用的制何首乌成分中未检测出何首乌主要肝毒性成分顺式二苯乙烯苷，这与上述研究的结论相符。有研究认为，二苯乙烯苷能够降低小鼠体内TNF-α的水平[27]。本研究结果显示，制何首乌组中性粒细胞分泌的TNF-α显著降低，同时制何首乌中反式二苯乙烯苷成分在正常范围内，提示反式二苯乙烯苷可能参与抑制中性粒细胞分泌TNF-α。本研究的模型为免疫活化模型，结果显示对照组小鼠的炎症程度、CD4+T淋巴细胞活化和CD8+T淋巴细胞分泌GZMB均显著高于制何首乌组，提示制何首乌可能通过抑制效应性T淋巴细胞的活化阻断小鼠肝脏的炎症进展。

如何避免何首乌引起的肝毒性已成为国内外的研究热点。国内一些学者研究出不同的炮制方法加工生何首乌，能够有效减少生何首乌内的肝毒性成分[28,29]。因此提高何首乌的炮制工艺能够有效减少肝毒性事件发生。有研究认为，HLA-B*35:01等位基因是何首乌引起药物性肝损伤事件的高危因素，因此对于检出该等位基因的人群应避免使用何首乌[30]。

本研究的结果与研究前的假设截然不同，制何首乌不但没有加重免疫活化小鼠的肝损伤，反而起到了治疗作用。通常认为，正常状态下机体可能具有更强的耐受力，而病理状态下机体可能耐受力较低。但是，有一种理论描述的现象与其相反，这就是“有故无殒”。“有故无殒”出自《黄帝内经》，其指出药物毒与不毒，不仅在于药物本身，还在于是否对证(病)使用，换句话说就是“有病则病当之，无病则体受之”，这是中药传统毒理理论的重要内容，也是中医辩证用药的重要思想之一。庞晶瑶等[31]的研究结果显示，高剂量何首乌对于正常大鼠有肝毒性作用，而对于慢性肝损伤大鼠则有保护和治疗作用。这与本研究的结果相似，这更加支持了何首乌对肝脏的作用具有“有故无殒”的现象。

本研究发现制何首乌可通过抑制炎症发挥治疗作用，但样本量较少，仍需在更大的样本中进行验证。研究中炎症坏死灶内的巨噬细胞是M1或M2型巨噬细胞、制何首乌通过何种途径抑制巨噬细胞的募集、中性粒细胞和效应性T细胞的活化，以及制何首乌中某一种成分参与了治疗作用，亟待进一步研究。