李娇娇 师豆豆 黄启超 陶梅

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)目前是全球第六大最常见的癌症和第三大癌症死因[1]。由于肝癌的生物学特性，放射治疗和化学疗法不敏感，手术切除仍是最有效的肝癌治疗方法，但几乎70%的患者在切除后发展为复发性HCC[2]。因此,发现新的预后靶点，将有助于提高HCC患者生存率。

哺乳动物体内一共有26种脂酰辅酶A合成酶，其中长链脂酰辅酶A合成酶(ACSLs)主要负责活化最丰富的长链脂肪酸(C12 ～ C20脂肪酸)，活化的脂酰辅酶A通过参与脂质合成或脂质氧化来发挥生物作用。ACSL1是ACSLs家族中第一个发现的亚基，肝脏的ACSL1含量占ACSLs家族总含量的50%以上[3]。越来越多的研究表明，组织ACSL1的异常表达在肿瘤的发生、发展中占据重要作用。比如，在结肠癌[4-5]、甲状腺癌[6]、卵巢癌[7]中，ACSL1促进癌细胞不受抑制的增殖，开启不受调控的癌症代谢，促进肿瘤的侵袭和转移；在食管癌[8]、IDH1突变胶质瘤[9]中，ACSL1与肿瘤的生存率和预后存在密切联系。ACSL1在HCC中的作用尚不明确,且ACSL1在HCC中的表达情况尚存在争议[10-11]。因此该研究通过检测临床HCC组织样本ACSL1的表达并分析ACSL1对HCC患者预后的影响,在细胞层面观察ACSL1对癌细胞增殖、凋亡、能量代谢的影响，初步探讨ACSL1与HCC的关系及其对临床诊疗的意义。

资料与方法

一、一般材料

(一)组织样本及临床病理资料 HCC手术组织及临床资料来自空军军医大学西京医院和唐都医院2010年1月至2016年12月的HCC队列，334例在肝胆外科诊断为HCC的癌组织及对应的癌旁正常组织石蜡包埋组织。癌组织的石蜡包埋组织均经病理检查确认，术前无放化疗，不伴有其他恶性疾病。临床资料包括患者的6年随访资料。该研究获得空军军医大学唐都医院医学伦理委员会批准。

(二)主要材料及试剂 人HCC细胞株 SNU739由空军军医大学基础医学院病理实验室赞助；胎牛血清、RPMI培养基、Trypsin-EDTA购自美国Gibco公司；ACSL1过表达的慢病毒质粒购自上海吉凯基因公司；ACSL1抗体、MTS检测试剂盒购自上海艾博抗贸易有限公司；β-actin 抗体和兔二抗购自Cell Signaling Technology；免疫组化试剂盒、蛋白上样Marker购自美国 Thermo Fisher 公司；DAB 显色试剂盒、BCA 蛋白定量试剂盒购自陕西中晖赫彩生物医药科技有限公司；青链霉素混合液、Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒、乳酸检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；XF测定培养基购自Seahorse Bioscience公司；24孔海马测定板购自安捷伦科技公司。

二、研究方法

(一)免疫组化检测癌组织与癌旁组织中ACSL1的表达 病理切片60 ℃恒温箱烤片20 min；二甲苯浸泡脱蜡；无水乙醇和3种由高到低浓度酒精依次浸泡水化；自来水冲洗；柠檬酸钠缓冲液抗原修复；PBS洗涤；H2O2水封闭内源性过氧化物酶；PBS洗涤；山羊血清阻断内源性过氧化物酶；ACSL1 抗体(1∶50)孵育，4 ℃过夜；PBS洗涤；生物素标记山羊抗兔IgG静置孵育15 min；PBS洗涤；辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育20 min；PBS洗涤；镜下DAB显色观察；苏木精复染；自来水冲洗；1%盐酸酒精分化；自来水返蓝；酒精和无水乙醇依次浸泡脱水；二甲苯浸泡透明；中性树胶封片；镜下观察：细胞染色强度判断：阴性0分，弱阳性1分，阳性2分，强阳性3分；细胞阳性率判断：<10%为0分，10%～30%为1分，31%～60%为2分，>60%为3分；细胞染色强度和阳性率的乘积为免疫结果，总分<2分为低表达，≥2分为高表达。

(二)细胞培养和慢病毒转染 配置含10%胎牛血清和1%青霉素、链霉素混合液的RPMI培养基，用于孵育SNU739细胞。把对数生长期的细胞用Trypsin-EDTA消化；细胞计数；6孔板种植转染(4×105/孔)：对照组(control)转染空质粒慢病毒，实验组转染ACSL1过表达慢病毒；待细胞长到50%时转染慢病毒：948 μL常规RPMI培养基 +40 μL感染增强P液 +12 μL病毒液(病毒浓度为 108/mL)；8 h后更换培养基；72 h后用1 μg/mL嘌呤霉素进行抗嘌呤霉素细胞筛选，将其传代培养。

(三)Western blot检测SNU739癌细胞ACSL1的表达 提取实验组和对照组细胞总蛋白；BCA法检测样本蛋白浓度；5×蛋白上样缓冲液使蛋白变性；取35 μg蛋白上样，10%SDS-PAGE电泳；250 mA、90 min恒流将蛋白转至PVDF膜；10%脱脂奶粉室温摇床封闭 3 h；ACSL1 抗体(1∶1 000)4 ℃孵育过夜；1×PBST 洗膜3次；二抗室温孵育1 h；PBST 再次洗涤3次；HRP-ECL化学发光液显影。

(四)MTS法检测ACSL1对SNU739细胞增殖能力的影响 取实验组和对照组对数生长期癌细胞，Trypsin-EDTA消化；细胞计数使细胞悬液浓度为 2×104个/ mL，加入96孔板，100 μL/孔；37 ℃、5%CO2培养箱孵育过夜，镜下观察；每孔加入20 μL的MTS(5 mg/mL)，孵育1 h；酶标仪490 nm 波长处检测细胞吸光度值，记录为起始值；同样的方法分别在24、48、72、96 h检测吸光度值。每组采用5个复孔，实验重复 3 次，记录数据并绘制细胞增殖曲线。

(五)流式细胞仪检测ACSL1对SNU739细胞凋亡的影响 取实验组和对照组对数生长期癌细胞，Trypsin-EDTA消化；细胞计数使细胞悬液浓度约为1×106个/mL；1 000 r/min，4 ℃离心10 min后收集细胞，弃培养基；用冷PBS 轻轻震荡使细胞悬浮，1 000 r/min， 4 ℃离心10 min后收集细胞，该步骤重复2次；200 μL 1×Binding Buffer 缓冲液悬浮细胞；向上述细胞悬液中加入10 μL Annexin V-FITC轻轻混匀，4 ℃避光孵育30 min；加入20 μL PI轻轻混匀，4 ℃避光孵育15 min；1 h内用流式细胞仪检测。

(六)Seahorse XF24分析仪检测ACSL1对SNU739细胞OCR的影响 Seahorse XF24分析仪检测前一天，在探针板中加入校正液后，放入37 ℃、无CO2的培养箱过夜进行活化；实验组和对照组的癌细胞以5×104个/孔接种到24孔板中，在37 ℃、CO2的培养箱中培养过夜；第二天，细胞培养板从培养箱中取出，记录时间，用XF测定培养基替换原来的培养基，将细胞板置于37 ℃无CO2的培养箱中1 h；正式测定前，进行预测试以发现每种抑制剂的最佳浓度：寡霉素(oligomycin)3 μmol/L，三氟甲氧基羰基氰化物苯腙(FCCP)1 μmol/L，鱼藤酮(ROT)4 μmol/L，抗霉素A 4 μmol/L；XF24细胞外通量分析仪上测量OCR，XF Cell Mito Stress Test Generator软件分析整理数据结果。

(七)乳酸试剂盒检测ACSL1对SNU739细胞乳酸的影响 实验组和对照组的癌细胞Trypsin-EDTA消化；PBS重悬，1 000 r/min，离心10 min，弃上清，留细胞沉淀；加入PBS缓冲液清洗1～2次，同样1 000 r/min，离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀；加入1%～2%的TritonX-100细胞裂解液0.2～0.3 mL, 4 ℃条件下裂解30～40 min，裂解好的液体不离心直接进行测定；取96孔板和乳酸试剂盒，将裂解液和测试试剂于EP管内混合，移入到96孔板；酶标仪在波长510 nm测定吸光度值，计算各组细胞内乳酸含量。

三、统计学分析

数据整理后，用SPSS 26.0和Graph Pad Prism 8.0进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验；计数资料分析用χ2检验；生存分析用Cox 比例风险回归。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、ACSL1在HCC癌组织及癌旁组织中的表达及癌组织中ACSL1与HCC患者临床病理特征关系

免疫组化检测显示，癌组织中ACSL1染色大多为弱阳性，而癌旁组织中大多为阳性至强阳性。癌组织及癌旁组织中 ACSL1 的免疫组化结果分别为3.02±2.57和7.60±3.34,癌组织的ACSL1表达显著低于癌旁组织(t=20.040,P=0.000),见图1。通过6年的随访资料，发现HCC中ACSL1表达与不同年龄存在相关性(P<0.000)，而与性别(P>0.05)、临床分期(P>0.05)均无关，见表1。

图1 HCC癌组织及癌旁组织ACSL1的表达

表1 ACSL1蛋白表达与HCC临床病理特征关系

二、HCC预后单因素和多因素Cox分析

首先将已知的可能影响HCC预后的临床资料进行Cox单因素分析，发现ACSL1蛋白表达、TNM分期与HCC的预后有相关性(均P<0.1)，而性别、年龄与预后无关(均P>0.5)；再将与HCC预后相关的因素作为自变量进行多因素Cox回归分析，发现ACSL1蛋白表达水平是HCC患者生存的危险因素(HR=1.642,P=0.012)，见表2。

表2 肝细胞癌患者预后单因素及多因素Cox分析

三、ACSL1对SNU739细胞增殖和凋亡的影响

Western blot验证实验组和对照组ACSL1蛋白表达，发现实验组ACSL1蛋白表达水平明显高于对照组，见图2A；MTS法检测ACSL1对SNU739细胞增殖的影响，发现实验组细胞增殖能力较对照组细胞显著减弱(F=45.056 ，P=0.003)，见图2B；Annexin V-FITC/PI双染法流式检测ACSL1对SNU739细胞凋亡影响，发现实验组细胞凋亡百分数显著高于对照组(t=13.886，P=0.000)，见图2C、2D。

A.Western blot验证SNU739细胞过表达ACSL1；B.MTS法检测ACSL1对HCC细胞增殖的影响；C.Annexin V-FITC/PI双染法流式检测实验组ACSL1对HCC细胞凋亡的影响；D. Annexin V-FITC/PI双染法流式检测对照组ACSLI对HCC细胞凋亡的影响

四、ACSL1对SNU739细胞能量代谢的影响

Seahorse XF24分析仪检测实验组和对照组细胞线粒体OCR，发现在加入FCCP后，随着时间进展，实验组细胞基础氧耗速率(F=83.429,P=0.001)、最大氧耗速率(F=859.792,P=0.000)明显高于对照组，解偶联呼吸较对照组增强(F=11.579,P=0.027)，见图3；乳酸试剂盒检测实验组和对照组细胞乳酸含量，发现实验组细胞乳酸含量低于对照组的(t=4.585，P=0.010)。

图3 Seahorse XF24分析仪检测ACSL1对HCC OCR的影响

讨 论

HCC是由感染以及与慢性坏死性炎症相关代谢物和毒物诱发的癌症范例。尽管这些发现已转为一级和二级预防措施，以及疾病的模型系统，但临床上特征明显的HCC预后仍然很差[1,12]。因此,发现新的HCC预后标志物，将更有利于改善HCC患者的预后。生理条件下，ACSL1以ATP依赖的方式将特定的游离长链脂肪酸活化为脂酰辅酶A，作为代谢变阻剂调节肝脏[13]、心脏[14]、骨骼肌[15]和脂肪组织[16]的脂质代谢。研究表明，当肝脏中ACSL1表达异常时，可使肝脏的脂质代谢失调，导致肝脏功能异常，甚至发生肝恶变[17-18]。本研究旨在探讨ACSL1在HCC中的表达及对HCC预后、HCC细胞株SNU739增殖和凋亡的影响，并且初步探究ACSL1在HCC中的作用机制。

Cui等[10]在探究肝癌中特异性过度表达的lncRNA(Highly upregulated in liver cancer ，HULC)对HCC脂质代谢紊乱的作用时，发现ACSL1可被HULC显著上调，并且免疫组化检测ACSL1在临床HCC组织样本的表达，发现ACSL1在HCC癌组织中的表达强于癌旁组织。Muir等[11]报道，在磷酸酶和张力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，Pten)诱导的小鼠HCC和小鼠非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，对小鼠HCC组织和NASH组织进行广泛质谱分析，发现Pten缺失的HCC中，ACSL1 mRNA的表达明显下调，并且与癌旁NASH组织相比，ASCL1在肿瘤组织中的表达也显著降低。本研究通过免疫组化分析334例HCC患者癌组织及癌旁正常组织中ACSL1表达情况，发现癌组织中ACSL1的表达要较癌旁组织低；进一步分析HCC中ACSL1表达与HCC临床病理特征关系，发现ACSL1的表达与HCC患者的年龄和临床分期显著相关，与其他临床病理无相关；在 HCC预后单因素和多因素Cox分析中,发现ACSL1低表达的HCC患者预后更差，ACSL1蛋白表达水平是HCC患者生存的危险因素。

Guo等[6]发现，甲状腺癌中小核仁RNA宿主基因7表达上调，可降低miR-449a表达，进而上调ACSL1促进癌细胞增殖和迁移，抑制癌细胞凋亡。Chen等为了验证ACSL1对大肠癌的致癌作用和对肺癌的抑制作用，将两种表达ACSL1 shRNA的慢病毒颗粒分别导入大肠癌HCT116细胞和肺A549细胞中，发现ACSL1 shRNA抑制HCT116细胞的增殖，但促进A549细胞的增殖[19]。本研究在慢病毒构建的ACSL1过表达SNU739细胞中，发现ACSL1可减弱SNU739细胞增殖能力，而显著促进其凋亡，说明ACSL1在HCC的进展中可能介导一种特定机制。

Cassim等证实HCC表现出普遍的糖酵解代谢，但在葡萄糖缺乏的情况下，脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，FAO)被激活，可以为癌细胞供应能量并促进增殖[20]。 Sangineto等[8]报道，癌细胞中FAO被激活后，电子传输链的过度活性可能产生活性氧和氧化损伤，导致癌细胞死亡。而在缺氧诱导因子-1α介导的FAO抑制，有利于肝癌细胞对低氧环境的适应，但是在常氧条件下增强的FAO对肝癌的生长没有影响[21-22]。可见，FAO在HCC进展中的作用和HCC所处的背景有很大的相关性，需要更广泛的研究来了解癌症代谢重新编程对FAO的影响。线粒体是细胞的能量加工厂，产生的 ATP为机体的基本生命活动提供能量。本研究通过检测实验组细胞和对照组细胞的线粒体OCR和乳酸含量，初步探究ACSL1对HCC能量代谢的影响，结果表明实验组细胞线粒体OCR明显高于对照组，而乳酸含量明显低于对照组。提示与对照组细胞的糖酵解供能相比，ACSL1过表达的肝癌细胞能量供应主要来源线粒体的三羧酸循环。

本研究的不足之处是未能进一步明确ACSL1异常表达对HCC能量代谢重编程的具体机制。但结合前文描述，我们推测，ACSL1可能通过FAO途径参与线粒体三羧酸循环，进而参与HCC的发生、发展。下一步我们将结合动物实验，进一步深入探讨ACSL1在HCC中的具体机制，并且借ACSL1相关研究进一步揭示FAO异常在HCC参与的新途径。