孙飞 彭昊

激素性股骨头坏死（glucocorticoid-induced osteonecrosis of the femoral head，GIONFH）的主要病理组织病变是骨和成骨的细胞凋亡，其发病风险与激素的使用剂量和持续时间呈正相关［1-2］。Kubo等［3］通过流行病学调查发现发生股骨头坏死首要相关因素是激素的使用（发病率为51%）。Cooper等［4］发现近两年内全身性使用糖皮质激素是发生骨坏死的重要危险因素，其中75.9%的骨坏死发生在髋关节。Weinstein等［5］发现30%～50%长期使用激素的病人会出现骨质疏松症性骨折，9%～40%出现股骨头坏死等骨骼系统并发症。Long 等［6］在一项长期接受激素治疗的单中心研究中发现，股骨头坏死病人中57.1%出现孤立的股骨头坏死，42.9%会有多个关节受累。Al-Omari等［7］和Thompson等［8］报道髋关节炎病人单次髋关节糖皮质激素注射也会引起股骨头坏死。多国学者达成了GIONFH 分类标准的共识［9］：①病人应有糖皮质激素使用史或者3个月内使用泼尼松龙（＞2 g）或等效药物；②在使用糖皮质激素后2年内确诊骨坏死；③病人除糖皮质激素外不应有其他危险因素。

当前，GIONFH的发病机制主要包括：脂质代谢紊乱、血管内皮损伤、凝血异常、骨内高压、骨细胞凋亡和基因多态性等［1］。Eberhardt 等［10］发现接受激素治疗的兔股骨头内TUNEL阳性骨和成骨细胞死亡比例占到检测区域的一半，而在对照组仅检测到少量TUNEL 阳性细胞，这表明细胞凋亡是激素诱导股骨头坏死的早期事件。Weinstein［11］发现GIONFH标本内有大量凋亡的骨细胞，而其他髋关节置换病人（如镰状细胞增多症和股骨颈骨折）则没有凋亡的骨细胞，他们认为GIONFH 的细胞学基础实质是骨细胞的凋亡。由此可见骨细胞凋亡是GIONFH 病程演变中的重要事件。研究骨细胞凋亡发生机制及凋亡信号通路的调控，将为预防和治疗GIONFH提供重要的理论依据。在此本文将对GIONFH发病机理中细胞凋亡相关研究进展进行综述。

一、文献检索及筛选策略

本文以“股骨头坏死”“糖皮质激素”“成骨细胞”“骨细胞”“细胞凋亡”为中文关键词在中国知网、万方数据库中检索；以“osteonecrosis of femoral head”“glucocorticoid”“osteocyte”“osteoblast”“cell apoptosis”为英文关键词，在PubMed、Web of Science中进行检索。

文献纳入标准：糖皮质激素引起的股骨头坏死与细胞凋亡相关的文献。文献排除标准：①文献质量偏低或重复性研究；②无法获取全文或重复发表的文献；③非中英文文献；④Meta分析、学位论文、会议论文文献。本文共检索文献778篇（PubMed检索321篇，Web of Science 289篇；中国知网101篇，万方数据67 篇），最终纳入58 篇，其中中文文献3 篇，英文文献55篇（图1）。

图1 文献筛选流程图

二、GIONFH中细胞凋亡的相关基因

（一）糖皮质受体

糖皮质激素受体（Glucocorticoid receptor，GR）是一种配体激活的转录因子。在不存在配体的情况下，GR 作为包含Hsp90 分子伴侣复合物的一部分保留在细胞质中，激素结合后被激活易位至细胞核，调节携带特定GR 结合序列的基因转录。Gu 等［12］用地塞米松（Dex）处理骨细胞和成骨细胞后明显检测到GR 的激活和核转位，GR 拮抗剂米非司酮（RU486）可明显抑制Dex 诱导的骨细胞凋亡。Rauch 等［13］发现激素的使用对GR 基因功能丧失的转基因小鼠的骨形成速率、骨量和小梁厚度没有影响。GR 缺失会使成骨细胞对激素诱导的细胞凋亡、增殖和分化的抑制产生明显的抗性。以上研究表明，GR 在激素诱导的骨细胞凋亡中有重要的作用。

（二）11β-羟基类固醇脱氢酶-2

11β-羟基类固醇脱氢酶（11β-HSD）主要包括11β-HSD-1 和11β-HSD-2。11β-HSD-1 将不活跃的11-脱氢皮质酮转化为活性皮质酮，而11β-HSD-2则使皮质酮失活阻止糖皮质激素与GR 的结合。天然与人工合成的糖皮质激素对11β-HSD-2的反应性有所不同。Dex中的B环9α位被氟化，既增强了药效又使11β位闭塞，从而使得11β-HSD-2 对Dex 灭活作用减弱［11］。Weinstein 等［14］发现转基因小鼠成骨细胞中11β-HSD-2的特异性过表达可以抑制激素诱导的细胞凋亡，促进骨的形成、增加骨内脉管系统容量和改善骨强度。Wang 等［15］在兔GIONFH 模型检测到11β-HSD-1蛋白的表达升高，而11β-HSD-2 明显降低。Zhang 等［16］发现过表达11β-HSD-2可使Dex诱导的小鼠骨和成骨细胞凋亡率明显减少，Fas 和Caspase-8明显降低，而用siRNA 敲低11β-HSD-2表达水平后，细胞凋亡率、Fas 和Caspase-8 表达水平明显增高。以上研究表明11β-HSD-2 可能是预防类固醇治疗病人发生股骨头坏死的重要靶标。

（三）Bcl-2家族

Bcl-2 蛋白家族按功能主要分两大类，一类包括Bax、Bad、Bim 等，主要通过Caspase-9 的激活诱导细胞凋亡；另一类包括Bcl-2、Bcl-W、Bcl-xL 等，通过抑制Bax 亚家族蛋白，阻止Caspase 激活剂从线粒体中释放，而抑制细胞凋亡。Li等［17］发现Dex明显抑制抗凋亡基因Bcl-2表达并促进促凋亡基因Bax 的表达水平来诱导成骨细胞凋亡。Moriishi 等［18］发现在Bcl-xL转基因小鼠中，上调Bcl-xL后骨小梁的骨矿物质密度增加，股骨小梁骨体积和皮质厚度增加，TUNEL阳性成骨细胞数目明显减少。Tian等［19］发现，兔GIONFH组TUNEL染色中骨小梁和骨髓中骨细胞凋亡比例明显增高，免疫组化染色显示Bcl-2表达量明显降低，Caspase-3明显增高。另外，Espina等［20］发现用1 μmol/L Dex处理成骨细胞48 h时Bim的表达水平最高，而GC 受体拮抗剂可阻止Dex 对Bim 蛋白诱导表达，特异性针对Bim 或下游效应器Bax 的短干扰RNA（siRNA）均可减少Dex 诱导的成骨细胞凋亡，表明Bim 是成骨细胞凋亡中受到GC受体的转录调控的重要调节剂。

（四）P53基因

正常的P53 基因是细胞周期G1 期DNA 损伤点，可通过上调C-myc、Fas抗原，下调Bcl-2基因，提高细胞内Ca2+浓度，诱发细胞凋亡。Zhen 等［21］发现Dex 诱导的成骨细胞凋亡与GR-P53调控的线粒体膜电位转换孔（mPTP）开放有关。Dex诱导P53磷酸化易位至线粒体，在线粒体中P53与CyPD形成复合物，诱导mPTP开放，使线粒体膜电位降低，促进细胞色素C 释放，诱导细胞凋亡。而siRNA 敲低GR 或P53 抑制剂则可抑制Dex诱导的CyPD-P53结合，逆转Dex诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。Li等［22］发现Dex可增强P53转录激活性，上调P21、促凋亡基因NOXA和PUMA，诱导鼠成骨细胞凋亡和G1期阻滞，而siRNA-P53 则可逆转Dex 诱导的细胞周期阻滞和凋亡。另外，Zhou等［23］发现Dex通过促进USP14的表达去除P53 的泛素化而提高P53 的稳定性，诱导MC3T3-E1 细胞凋亡，而P53抑制剂PTF-a则可部分阻断细胞凋亡。

（五）Fas/FasL

Fas是一种位于各种细胞表面的死亡受体，Fas及其配体FasL 的相互作用调节许多程序性细胞死亡介导的生理和病理过程。Kawakami 等［24］发现人成骨细胞上表达Fas，可溶性FasL 可以激活Fas 诱导成骨细胞凋亡。Kogianni 等［25］发现Dex 不仅能上调骨细胞质膜上Fas 蛋白，诱导Fas/FasL 死亡受体信号通路，还能激活ERK和Fas的传递，发挥协同作用，诱导骨细胞凋亡。

（六）GSK3β

GSK3β是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调控细胞内众多关键信号通路。GSK-3β在丝氨酸9（Ser-9）和酪氨酸216（Tyr-216）位点的磷酸化则分别代表GSK3β的失活和激活。Yun 等［26］发现Dex 可以降低Ser-9、升高Tyr-216 处GSK3β磷酸化水平来激活GSK3β 诱导成骨细胞的凋亡，而LiCl（GSK3β抑制剂）的处理则可增加GSK3β Ser-9逆转Dex诱导的细胞凋亡。Deng 等［27］发现大鼠GIONFH 的组织中GSK3β增加，而GSK3β Ser-9 的磷酸化水平明显降低。与大鼠SIONFH 模型GSK3βSer-9 变化趋势一致的是，GSK3β Ser-9在Dex处理的成骨细胞中表达水平也明显降低。而用siRNA敲低GSK3β后，Bax和Caspase-3降低，Bcl-2和β-catenin表达量增加。以上研究表明GSK3β的活性在激素处理的骨细胞的凋亡中发挥重要作用。

（七）Pyk2

Pyk2 是非受体酪氨酸激酶的粘附灶激酶家族的成员。Plotkin 等［28］发现Dex 在酪氨酸402 位点磷酸化Pyk2 而影响细胞存活，敲低Pyk2 则可减轻Dex 诱导的细胞凋亡作用，而过表达Pyk2后细胞凋亡又会重新出现。在表达Pyk2的激酶缺陷或磷酸化缺陷（Y402F）的骨细胞中，Dex 则不能够诱导细胞凋亡。Iuchi 等［29］发现糖皮质激素还能诱导细胞内Ca2+迅速升高而激活Pyk2，Pyk2激活继而导致JNK（Pyk2活化的下游靶点）激活，继而引起细胞凋亡。Ding 等［30］发现在骨细胞MLO-Y4 和成骨细胞OB-6 细胞中，Dex 可以诱导激活TAK1 引起的Pyk2-JNK 磷酸化，诱导骨细胞MLO-Y4 和成骨细胞OB-6凋亡。

（八）STAT家族

STAT1 是STAT 蛋白家族的成员之一，激活后可诱导细胞凋亡。Feng 等［31］发现Dex 可促进成骨细胞P-STAT1 明显的核转位而增强其转录活性，用siRNA抑制STAT1可显著降低Bax、cleaved-Caspase-9和cleaved-Caspase-3，降低Dex诱导的成骨细胞凋亡。Xu 等［32］发现GIONFH Ficat Ⅰ-Ⅴ型病理组织中STAT1、P-STAT1 和Caspase-3 表达量也明显升高。Yan 等［33］发现Dex 处理的成骨细胞P-STAT3/STAT3 的比例，cleaved-Caspase-3 和cleaved-Caspase-9 表达量升高，而PSTAT3的抑制剂处理后，cleaved-Caspase-3，cleaved-Caspase-9的表达量则显著降低，细胞凋亡率也明显减少。Lin 等［34］发现氟达拉滨（STAT1 抑制剂）可以明显降低激素诱导的股骨头坏死模型中骨细胞空骨陷窝的比例，降低P-STAT1，cleaved-Caspase-3和cleaved-Caspase-9蛋白的表达水平。此外，Jin 等［35］发现姜黄素可抑制JAK1/2-STAT1途径引起小鼠股骨头M1型巨噬细胞的浸润来防止炎症介导的骨细胞凋亡。

（九）Caspase家族

胱天蛋白酶家族与细胞凋亡过程密切相关，在功能上可分为两大类，包括启动者（initiator）和效应者（effector）。一旦启动者（胱天蛋白酶8、9 和10）被激活，执行者（胱天蛋白酶3、6和7）获得蛋白水解活性将作用于靶蛋白，不可逆转地启动细胞凋亡程序。Liu等［36］研究发现半胱天冬酶抑制剂（calbindin-D 28k）可以明显抑制Caspase-3活性，从而抑制Dex诱导的骨和成骨细胞的凋亡。此外，Yun等［26］发现胱天冬酶抑制剂Z-VAD-fmk 可以防止Dex 诱导的成骨细胞线粒体膜电位的降低而减少细胞凋亡，这表明Dex 通过Caspase 的活化诱导成骨细胞凋亡。Zhan 等［37］研究发现Dex 可抑制大鼠成骨细胞中磷酸化AKT 表达水平，提高cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9表达水平，诱导细胞凋亡。Cui［38］等发现红花多糖通过抑制Caspsae-3 介导的细胞凋亡来减轻Dex 相关的骨坏死。龚瑜林等［39］发现兔GIONFH组股骨头内Caspase-9表达明显增高，Caspase-9阳性率和骨细胞凋亡率呈正相关，以上表明Caspase在GIONFH骨细胞凋亡中发挥重要作用。

（十）低氧诱导因子-1α

激素诱导的低氧诱导因子-1α（HIF-1α）活性下降可能在骨坏死中发挥作用。Xu 等［40］发现Dex 能降低MC3T3-E1中HIF-1α和PDK1表达而抑制成骨功能，而过表达HIF-1α则增加PDK1的表达，二氯乙酸盐（PDK1的拮抗剂）可明显抑制MC3T3-E1 细胞的成骨能力，这表明Dex 通过HIF-1α调控PDK1来影响成骨功能。赵振群等［41］在兔GIONFH模型中发现，坏死区空缺骨陷窝率与骨细胞凋亡呈正相关，而HIF-1α的阳性表达率和骨细胞凋亡呈负相关。Li 等［42］也发现大鼠GIONFH模型中HIF-1α表达量明显降低，而局部注射促红细胞生成素可以升高HIF-1α控制的成骨和血管生成因子的表达，从而修复激素引起的股骨头坏死。Jing 等［43］发现去铁胺能激活HIF-1α/VEGF 通路并促进GIONFH 中的血管生成和骨修复。Xu 等［44］发现Dex 诱导鼠骨细胞MLO-Y4 中HIF-1α表达水平下调，从而减弱线粒体自噬的保护功能，而过表达HIF-1α则提高细胞对缺氧环境的抵抗力。Weinstein 等［45］发现接受泼尼松龙治疗的小鼠股骨头内HIF-1α和VEGF 表达水平明显降低，成骨细胞数量和骨形成减少，而破骨细胞增加，并且HIF-1α和VEGF 表达水平、骨血管分布和强度的降低先于骨量丢失和骨微结构恶化，从而导致股骨头容易塌陷。

（十一）血红素加氧酶-1

血红素是一种诱导血红素加氧酶-1（HO-1）的物质，具有抗炎和抗氧化特性。Liang 等［46］发现服用Dex 病人股骨头坏死组织中HO-1 mRNA表达水平明显下调。Yamamoto等［47］研究发现血红素可以诱导小鼠骨细胞MLO-Y4中的HO-1表达。血红素可降低Capase-3活性，减少糖皮质激素和缺氧引起的细胞凋亡，而HO-1 抑制剂处理后HO-1 表达水平降低、Capase-3 活性明显增加，即HO-1 抑制剂削弱了血红素的细胞保护作用。这意味着血红素细胞保护作用是由HO-1 和Caspase-3介导的。

三、其他

（一）内质网应激

内质网（ER）应激可通过PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路来介导细胞应对压力反应，PERK 介导的eIF2α磷酸化可通过抑制生存蛋白和促进凋亡蛋白的合成而导致细胞死亡。Tao等［48］发现Dex可诱导PERK磷酸化而激活PERK、诱导促凋亡蛋白CHOP的表达上调和抑制Bcl-2的表达而促进成骨细胞的凋亡。另外，Liu等［49］发现随着Dex的浓度增加，成骨细胞中CHOP 和ATF4 的表达逐渐增强，细胞凋亡比例增加。Yang 等［50］发现Dex 处理成骨细胞后，ER 应激的关键基因GRP78、CHOP 和eIF2α的磷酸化水平升高，表明ER 应激参与GC 诱导的成骨细胞的凋亡，而4-苯基丁酸（ER 应激的抑制剂）可抑制ER 应激，减少GC 诱导的MC3T3-E1 细胞凋亡。以上结果表明Dex可激活ER应激来促进成骨细胞凋亡。

（二）一氧化氮

一氧化氮（NO）在骨细胞功能中起着核心介质作用。eNOS 和iNOS 是体内NO 产生的重要标志。Inkielewicz-Stepniak等［51］发现Dex可以使细胞毒性介质NO的异常产生过度积累从而产生细胞毒性，诱导成骨细胞凋亡。Calder 等［52］发现GIONFH 组中骨细胞和成骨细胞中eNOS、iNOS、PARP 和Caspase-3 的表达量明显高于骨关节炎组，可能原因是异常产生的NO 对骨骼修复和重塑过程产生有害影响，从而导致大量的骨细胞和成骨细胞凋亡。

（三）氧化应激

激素诱导的股骨头坏死可能由氧化损伤引起。Nie等［53］研究发现Dex可引起成骨细胞的线粒体跨膜电位的降低，细胞内ROS和Ca2+水平的升高，ROS抑制剂和钙螯合剂的使用明显降低了Dex诱导的成骨细胞凋亡率。Bai等［54］发现高剂量的Dex可引起成骨细胞内ROS增加，而ROS激活了细胞内MAPK 信号途径，诱导磷酸化的ASK1和P38表达增加，引起成骨细胞凋亡，而ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）则可以逆转此效应。Peng 等［55］研究发现GIONFH 大鼠股骨头内骨细胞凋亡和空骨陷窝比例明显比对照组增多。Dex 处理后大鼠成骨细胞内ROS 水平升高，线粒体膜电位降低，细胞凋亡比例增高，而NAC处理则可恢复线粒体膜电位水平，逆转Dex诱导的细胞凋亡。在激素诱导的兔骨坏死模型中，抗氧化剂维生素E的使用可降低活性氧的产生，明显降低骨坏死的发生率［56］。Deng 等［57］发现Se@SiO2纳米复合材料的使用可以诱导超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的生成而降低ROS损伤，从而预防甲泼尼龙引起的股骨头坏死。

（四）表观遗传修饰

Zhao 等［58］认为表观遗传修饰可能是激素引起的骨坏死的主要原因。TET 蛋白可以催化5-甲基胞嘧啶（5mC）向5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）的转化，然后改变DNA 的表观遗传状态。Dex使用后股骨头组织和MLO-Y4细胞中TET3-5hmC上调。他们还发现沉默MLO-Y4 细胞中TET3 的表达可降低5hmC富集水平，从而消除Dex对Akt信号通路抑制，逆转Dex诱导的细胞凋亡。同时，在大鼠中局部进行siRNA-TET3 髓内注射可消除激素诱导的骨细胞凋亡，逆转激素对大鼠股骨头内骨微结构的不良影响，因而表观遗传修饰可能是GIONFH新的潜在治疗靶标。

四、小结及展望

最近有不少学者从新的治疗措施（脐带血间充质干细胞诱导细胞分化、富血小板血浆和外泌体治疗），非编码RNA，细胞自噬以及基因多态性等多方面对GIONFH进行了报道，但是，非常明确的是，糖皮质激素对骨细胞和成骨细胞有直接的毒副作用，其诱导骨细胞或成骨细胞凋亡是GIONFH病变中的重要细胞学基础（见图2）。

图2 GC诱导骨/成骨细胞凋亡的相关机制（绘图作者 孙飞）

GIONFH 的多因素发病机制使得预测其发生非常困难，但其发生率随着剂量和持续时间的增加而增加，并且药效时间越长的药物副作用越明显。研究糖皮质激素激活和调控骨/成骨细胞凋亡信号通路的机制，不仅有助于揭示疾病的发生发展进程，有助于提前采取预防和干预措施以降低激素的毒副作用，还能为研发新的毒副作用更小的创新药物提供重要理论依据。