姜鑫 陈文静 苏杭 申福国 肖文龙 孙文彩

摘要：目的：探讨葛根素对激素性股骨头坏死（SONFH）成骨的促进作用。方法：（1）30只6月龄健康成年新西兰大白兔，雌雄各半，随机分为对照组、模型组和葛根素组，每组9只。新西兰兔应用马血清和甲基强的松龙（MPS）建立体内SONFH模型，建模成功后然用葛根素治疗，常规苏木精-伊红染色观察股骨头组织形态学改变。（2）从健康家兔分离成骨细胞，分别给予地塞米松和葛根素单独或联合治疗，采用CCK-8法测定成骨细胞活力及应用茜素红法评价矿化结节的形成。（3）应用qRT-PCR和westernblot检测股骨头坏死组织中RUNX家族转录因子2（RUNX2）和miR-34a的表达。结果：葛根素可减轻SONFH对家兔组织病理学异常的促進作用，对抗SONFH对RUNX2和miR-34a表达的抑制作用。兔成骨细胞分离成功，呈红色矿化结节。地塞米松暴露降低成骨细胞的活力，葛根素治疗增加了这种活力。此外，葛根素治疗减弱了地塞米松对成骨细胞活力、成骨细胞分化以及RUNX2和miR-34a表达的抑制作用。结论：葛根素通过miR-34a上调促进激素性股骨头坏死的成骨和激素性骨细胞的成骨。

关键词：葛根素;激素性股骨头坏死;成骨;成骨细胞;miR-34a

【中图分类号】R816.8 【文献标识码】A 【文章编号】1673-9026（2021）07-130-02

激素性股骨头坏死（SONFH）的特征是骨细胞进行性坏死[1]。糖皮质激素的长期使用或过量摄入是诱发股骨头坏死的主要诱因之一[2]，然而，SONFH的发病机制仍不十分明确。最近的研究推测，可能与激素诱导的成骨细胞凋亡、成脂与成骨分化失衡及股骨头微循环受损等相关。成骨细胞来源于成熟的成骨细胞和间充质前体，对骨生长和骨基质形成至关重要[3]。成骨细胞可以与破骨细胞相互作用，维持骨内稳态[4]。在骨重塑过程中，成骨细胞分化和破骨细胞生成的不平衡会导致骨组织系统性破坏所反映的病理状态，进而导致骨减少、骨溶解甚至骨坏死[5]。通过促进破骨细胞分化和保护骨重塑的相关机制，天然化合物的使用已被广泛应用于治疗SONFH[6]。

葛根素是从葛根中提取的一种异黄酮类植物雌激素，与雌二醇结构类似，具有雌激素样作用[7]。葛根素可与骨细胞雌激素受体（ER）结合，促进成骨细胞的增殖与分化，增加骨密度和骨强度，并能直接抑制破骨细胞骨吸收，促进骨形成的作用[8]。然而，葛根素促进成骨细胞介导的骨形成的机制尚未完全阐明，为探讨葛根素促进成骨细胞向SONFH分化的可能机制，本项目通过建立兔体内模型和成骨细胞体外模型对其进行研究。

1材料与方法

1.1实验动物

购自济南金丰实验动物中心的30只6月龄健康成年新西兰大白兔，雌雄各半。所有动物实验均按照中国动物保护与使用委员会的指导方针进行。实验地点在齐齐哈尔医学院第三附属医院进行，使动物的疼痛和不适降低到最小化，

并获得齐齐哈尔医学院第三附属医院实验动物委员会批准（批准号：DO2019120）。

1.2主要仪器

光学显微镜，倒置显微镜蔡司（Axio Vert.A1，卡尔蔡司，德国Oberkochen;放大倍数：200×），荧光实时定量 PCR 仪 （ Agilent Technologies Mx3000P ） ; 分 光 光 度 计（ GENESYS 140/150）。

1.3方法

1.3.1体外SONFH模型的建立

所有的兔子在接受实验前都经过了一周的驯化，将家兔随机分为对照组、模型组和葛根素组，每组9只。SONFH模型组，于第0天在耳静脉注射10ml/kg马血清（HS）3周后在耳静脉注射HS（6ml/kg），两周后，家兔腹腔注射甲基强的松龙（40mg/kg）（MPS）3天。在激素给药期间，青霉素（100000 U）可预防感染给每只兔子7天。

1.3.2苏木精-伊红染色

建立SONFH模型后，将股骨头标本固定在4%多聚甲醛，10%EDTA溶液（EDS，EDS）脱钙2个月，脱钙样品梯度乙醇中脱水，切片后苏木精—伊红染色，在光学显微镜下观察了美洲马州沃尔特马州的Thermofher组织形态学变化×大200倍，SONFH病变根据先前确定的标准[9，10]进行测定。

1.3.3成骨细胞的分离与鉴定

取出4只健康雄性新西兰大白兔颅骨，将头骨切成小块，在PBS中冲洗三次，并用0.25%胰蛋白酶0.1%I型胶原酶消化骨组织，在1000℃下离心30分钟，收集下层细胞，转移至培养瓶中，加入高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基。培养瓶放置在37℃ 中培养并进行细胞传代，取第三代细胞在倒置显微镜下进行确认。

1.3.4细胞处理与细胞转染

分离的成骨细胞用5%CO2在37℃F-12培养基中培养，然后暴露于地塞米松（Dex，D4902，C22H29FO5，纯度≥ 97.0%，）0，0.1，1，5和10μM或用不同剂量（0、0.1、1、5和10μM） ，以二甲基亚砜（DMSO）预溶葛根素为研究对象，分别确定建立SONFH体外模型和葛根素治疗的最佳浓度。

将分离出的成骨细胞分为5组，即对照组（空白对照组）、Dex组（成骨细胞暴露于1μM-Dex处理24h），葛根素组（成骨细胞预处理0.1μg/ml）μM葛根素24小时，暴露于1μM-Dex转染24h），葛根素+MC组（模拟对照转染后，用0.1μmol/l的浓度预处理成骨细胞μM葛根素24小时，暴露于1μM-Dex转染24h），葛根素+M组（miR-34a模拟转染后，成骨细胞用0.1μmol/l预处理μM葛根素24小时，暴露于1μM指数为24小时）。所有处理过的基因和lipofectamine3000转染试剂在37℃共同孵育℃ 10分钟后，将孵育液和基因脂质复合物加入成骨细胞中，37℃孵育48小时℃。

1.3.5定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）

分别用Trizol试剂和PureLink miRNA分离试剂盒从分离成骨细胞中提取总RNA和miRNA，用氯仿对总RNA和miRNA进行分层，异丙醇沉淀，75%乙醇洗涤，在无RNase水中溶解。利用上标IV逆转录酶合成了相应的cDNAs，然后在PCR检测系统下，相关基因表达量用2计算-ΔΔCt方法。

1.3.6细胞计数试剂盒（CCK-8）分析以及茜素红染色

CCK-8试剂测定成骨细胞的活性，CCK-8试剂（10μ五十） 在37℃时加入每个孔中的贴壁细胞进行细胞培养℃ 2小时，通过分光光度计（GENESYS 140/150）记录450 nm处的细胞吸光度。

茜素染色检测成骨细胞钙结节，成骨细胞加入茜素红工作液，37℃孵育℃ 在倒置显微镜下观察成骨细胞中矿化结节的形成× PBS冲洗后放大。

1.3.7蛋白质印迹

通过RIPA缓冲液从分离的成骨细胞中提取总蛋白。用增强化学发光试剂盒显示蛋白条带，用ImageJ软件（1.52s版）分析条带强度。

1.3.8统计分析

使用SPSS软件进行统计分析。测量数据以平均值表示± 标准差。Shapiro-Wilk检验检测正态分布。多组间比较采用单因素方差分析，事后配对比较采用Tukey检验。P<0.05具有统计学意义。

2结果

2.1葛根素能减轻MPS诱导的兔组织病理学异常，并对抗MPS和miR-34a表达的抑制作用

如图1A所示，我们观察到典型的股骨头坏死，骨小梁内有大量空骨陷窝或骨细胞核收缩，骨小梁周围有骨髓坏死，髓腔扩大，造血细胞明显减少，与对照组股骨头未见明显骨坏死相比，SONFH模型兔脂肪组织增生、肥大。家兔灌胃葛根素后，股骨头组织学特征均较模型组改善，骨小梁基本完整，排列不规则，偶见空骨陷窝，周围坏死骨髓细胞较模型组减轻（图1A）。这些结果表明葛根素可能对家兔的SONFH有保护作用。

注射多磺酸粘多糖后，测定兔股骨头中RUNX2 的表达。MPS诱导的SONFH兔的表达下调，葛根素逆转MPS对RUNX2表达的抑制作用（P<0.001;图1B-1D）。此外，先前的研究发现miR-34a减轻了Dex诱导的对成骨细胞分化的抑制作用[11]。如图1E所示，注射MPS可下调兔股骨头中miR-34a的表达，而葛根素治疗可减弱对miR-34a表达的抑制作用（P<0.001）。这些结果表明葛根素可能促进成骨细胞的分化，从而拮抗家兔的SONFH。

2.2成功分离出红色矿化结节的兔成骨细胞，地塞米松降低成骨细胞活力，葛根素提高成骨细胞活力

观察葛根素和地塞米松对成骨细胞活性的影响。茜素红S染色结果显示分离细胞中有红色矿化结节，表明兔成骨细胞已成功分离（图2A）。分别用不同浓度的地塞米松和葛根素处理离体成骨细胞。在暴露于Dex（1，5和10）24小时后，检测到成骨细胞活力的剂量依赖性降低μM） （P<0.01，P<0.001），而细胞暴露于浓度低于1μM没有显示成骨细胞活力的明显变化（图2B）。对照组用葛根素（0.1，1，5）治疗24，48hμM） 增加成骨细胞活力，葛根素0.1μM对成骨细胞活力的提高作用较强（P<0.05，P<0.01）;图2C，D）。

2.3葛根素通过上调miR-34a的表达，部分减弱Dex对兔成骨细胞成骨分化的抑制作用

地塞米松处理后miR-34a表达和成骨细胞活力均下降（P<0.01，P<0.001），葛根素可减轻地塞米松对这些因子的抑制作用（P<0.05，P<0.001;图3A，B）。此外，将miR-34a模拟物转染葛根素处理的成骨细胞后，进一步促进了葛根素增强miR-34a表达和成骨细胞活力的作用（P<0.05，P<0.001;图3A，B）。此外，暴露于Dex可减少红色矿化结节，降低RUNX2的蛋白表达（P<0.001），葛根素治疗可使这些表达减弱（P<0.001，图3C-3E）。值得注意的是，将miR-34a模拟物转染到葛根素处理的成骨细胞中也促进了葛根素对抗Dex对红色矿化结节形成和RUNX2蛋白表达的影响（P<0.001，图3C-3E）。这些结果表明葛根素可能通过上调miR-34a的表达，部分诱导成骨细胞分化，从而拮抗SONFH。

3讨论

糖皮质激素可导致骨细胞出现不可修復的缺损，引起骨坏死，扰乱骨代谢失衡，从而导致非创伤性股骨头塌陷[12]，可导致成骨和骨细胞凋亡，抑制骨祖细胞的增殖和向成骨细胞分化[13]。Weinstein的研究表明，接受糖皮质激素的小鼠表现出股骨头强度、股骨头矿物质密度和股骨头松质骨中成骨细胞数量减少，小梁宽度缩短。本研究采用HS和MPS联合给药的方法，在家兔上建立了SONFH的体内模型，根据上述结果，我们发现SONFH兔骨小梁周围有空骨陷窝或骨细胞核固缩，骨髓坏死。

Runt家族相关转录因子2（Runx2）是骨发育过程中激活与启动骨髓基质干细胞向成骨细胞分化并调节成骨细胞成熟的重要转录因子[14]，对成骨分化的发展和进展是不可或缺的，与一系列协同调节蛋白相互作用，为整合成骨细胞分化所需的细胞信号通路和基因表达的组织特异性调节提供了一种组合机制[15]。Fan的研究表明，在DEX诱导的骨质疏松兔中RUNX2蛋白水平下调，并且在DEX处理的MC3T3-E1细胞中抑制RUNX2的表达[16]。王海珍等人的研究证实抑制表达miR-196a-3p 的大鼠成骨细胞中Runx2 表达升高，而过表达Runx2明显促进成骨细胞增殖和分化[17]。与这些发现相似，我们的研究发现，HS和MPS联合给药可下调兔SONFH模型中RUNX2的表达。总之，目前的结果表明，股骨头从成骨分化向成脂分化的转变可能是糖皮质激素诱导股骨头坏死的原因。

葛根素是从葛根中药里提取的一种单体成分，属于植物雌激素，对成骨细胞的活性具有调节作用[18]。在我们的研究中，葛根素对MPS诱导的SONFH兔的作用与葛根素对酒精诱导的骨坏死小鼠的作用几乎相同。我们观察到葛根素逆转了多磺酸粘多糖对形态学改变的作用。此外，葛根素处理的MC3T3-E1细胞呈现上调的RUNX2表达[19]。本研究的体内实验表明，葛根素对MPS诱导的兔骨髓细胞坏死和股骨头塌陷有保护作用，并通过调节miR-34a的表达对抗Dex对成骨细胞成骨分化的抑制作用，与此同时，葛根素也能抑制多磺酸粘多糖诱导的家兔RUNX2 mRNA和蛋白质水平的上调。这些结果表明葛根素通过促进成骨分化逆转糖皮质激素对骨形成的抑制作用。

曾有研究表明，葛根素能够促进大鼠成骨细胞增殖和分化，并表明1.0umol/Lg葛根素效果最好[17]，本研究为进一步探讨葛根素促进成骨分化促进骨形成的机制，进行了细胞实验。分别用不同浓度的地塞米松和葛根素处理离体成骨细胞，以确定造模和葛根素处理的最佳浓度。先前的体外实验表明，葛根素治疗可促进成骨细胞增殖，增加矿化结节的形成，并增加成骨相关基因的表达[20]。与这些观察结果一致，我们的研究表明葛根素能提高成骨细胞的活力，促进成骨细胞的成骨分化和成骨相关基因的表达。

miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，通过调节靶基因转录后表达影响多种生物学过程，包括增殖、分化和凋亡等[21]。Yuan等[22]利用qRT-PCR证明SONFH患者组织中miR-34a表达上调，Kand [23]证实miR-34a具有促进成骨的作用。Zha等研究表明miR-34a在Dex给药后下调，上调的miR-34a通过促进小鼠骨髓间充质干细胞的成骨细胞分化而减轻糖皮质激素诱导的股骨头坏死[24]。在我们的研究中，我们检测到在MPS诱导的SONFH兔和Dex诱导的成骨细胞中miR-34a表达下调，并且证明上调的miR-34a在体外进一步促进葛根素的作用，表明miR-34a与葛根素的作用正相关。在这项研究中，虽然我们没有确定miR-34a在SONFH中促进成骨分化的基因或信号通路，但是我们为以后的研究提供了方向。

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