高春生 王小伟 高俊 许海霞 晏慧超 郑均华

骨肉瘤是一种临床常见，多发于儿童和青少年的恶性骨肿瘤，具有恶性程度高和预后效果差等特点。尽管新辅助化疗的应用使病人的预后得到显著改善，但其远期生存率仍不太理想［1-2］。研究表明［3-4］骨肉瘤细胞中存在包括微小RNAs（microRNAs，miRNAs）在内的多种基因的异常改变，而这些miRNAs 可通过结合靶基因的3’非编码区（UTR）调控转录后基因的表达，影响细胞的恶性生物学行为。miR-27b 是一种与多种肿瘤发生、发展密切相关的miRNA，被证实在结直肠癌、胃癌、宫颈癌和前列腺癌等肿瘤中异常表达，发挥着致癌或抑癌基因的作用［5-8］。近年来，有研究发现miR-27b 在骨肉瘤病人血清中异常高表达，且与肿瘤体积、肿瘤淋巴结转移（TNM）分级等有关，但其在骨肉瘤发生、发展中的作用如何尚不清楚［9］。因此，本研究旨在研究miR-27b 对骨肉瘤MG63 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制。

材料与方法

一、实验材料

人骨肉瘤细胞株MG63 购于中国科学院细胞库。胎牛血清购于浙江天杭生物科技股份有限公司，DMEM 培养液购于美国Hyclone，胰蛋白酶和细胞裂解液购于上海碧云天，Trizol试剂购于大连宝生物工程有限公司，青链霉双抗、二甲基亚枫和MTT试剂购于美国Sigma。FOXO1多克隆抗体购于美国CST，GAPDH 多克隆抗体购于美国SantaCruz，辣根过氧化酶标记的二抗购于武汉博士德。LipofectaminTM2000 购于美国Invitrogen，miR-27b 模拟物、miR-27b抑制剂及其阴性对照购于上海吉玛。细胞凋亡检测试剂盒购于北京索莱宝，双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于美国Promega，Matrigel 基质胶和流式细胞仪购于美国BD，ECL发光试剂盒和Transwell小室购于美国Millipore，酶标仪和凝胶成像系统购于美国Bio-Rad，倒置显微镜购于日本Olympus，细胞培养箱购于美国Thermo Fisher，荧光定量PCR 仪购于美国ABI。

二、细胞培养、分组及转染

MG63 细胞用DMEM 培养基常规培养。将MG63细胞分为模拟物对照组（转染miR-27b模拟物阴性对照）、miR-27b 模拟物组（转染miR-27b 模拟物）、抑制剂对照组（转染miR-27b抑制剂阴性对照）和miR-27b抑制剂组（转染miR-27b抑制剂）。按1×106个/孔的浓度将细胞液种植到6孔板上，细胞培养箱内常规培养过夜。待细胞汇合度达60%～80%时进行转染，首先用无血清培养液分别稀释待转染物和LipofectaminTM2000，室温孵育5 min 后，将两者混合。室温静置20 min 后，将上述复合物加到MG63细胞中，置于细胞培养箱中常规培养6 h后，更换新鲜培养液继续培养48 h，然后收集各组细胞，采用RT-PCR检测转染后miR-27b的表达情况。

三、RT-PCR检测miR-27b的表达

向待测的MG63 细胞中加入1 mL Trizol 试剂提取总RNA，逆转录成cDNA 后根据上海生工生物合成的PCR引物（miR-27b，F：5’-CCGGCCTTCACAGTGGCTA-3’，R：5’-CGGGTCGGTGGCAGAACTT-3’；U6，F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，R：5’-AACGC -TTCACGAATTTGCGT-3’），按照95℃3 min，95℃10 s、56℃30 s、72℃30 s（38 个循环）进行PCR扩增。以U6为管家基因，2-ΔΔCt法计算miR-27b的表达水平。重复3次。

四、MTT法测定细胞增殖

将转染后的MG63 细胞接种于96 孔板，分别培养24、48 h 和72 h 后，加入20 μL MTT 溶液（浓度为5 g/L），孵育4 h 后加入100 μL 二甲基亚枫，震荡反应，用酶标仪检测490 nm处的光密度（OD）值。

五、Transwell小室测定细胞侵袭和迁移

胰蛋白酶消化收集转染细胞后，以无血清培养基悬浮细胞制成浓度为3×104个/mL 的细胞液。将Transwell 小室放入24 孔板中，将稀释后的Matrigel基质胶铺满聚碳酸酯膜，室温下充分融合（注意：迁移实验中无此步骤）。在小室上室和下室中分别加入200 μL细胞液和600 μL含血清的培养基，每组设置3个平行孔，放入细胞培养箱中培养24 h。取出小室后，以棉签小心拭去上室中的液体，加入600 μL甲醇室温条件下固定细胞30 min。拭去上室中的固定液后，加入800 μL 0.5%结晶紫室温染色30 min。洗去染色液，晾干。于显微镜下随机选取5 个视野观察统计侵袭或迁移实验结果。

六、流式细胞仪测定细胞凋亡

收集细胞，磷酸缓冲液洗涤，结合缓冲液重悬，加入10 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI，避光、室温反应15 min，60 min 内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。

七、双荧光素酶报告基因实验验证miR-27b 与FOXO1的靶向关系

采用TargetScan 在线数据库预测到miR-27b 与FOXO1 的3’UTR 存在结合位点。为了验证miR-27b与FOXO1有无靶向关系，构建含野生FOXO1 3’UTR（FOXO1-WT）和突变FOXO1 3’UTR（FOXO1-MUT）的荧光素酶报告载体。将其分别与模拟物对照、miR-27b 模拟物、抑制剂对照和miR-27b 抑制剂共转染至MG63 细胞，其中每组设置3 个平行孔；培养48 h后，检测细胞的荧光素酶活性。

八、Western blot检测FOXO1蛋白的表达

向收集到的转染细胞中加入200 μL 蛋白裂解液，冰上裂解30 min获取总蛋白。煮沸5 min变性后取80 μg 上样至12% SDS-PAGE 凝胶中，以90 V 电压电泳30 min 后改换成120 V 电压，电泳70 min 结束。再以210 mA 电流转膜50 min。取出PVDF 膜后，以5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h。经1∶1 000倍稀释的FOXO1 和GAPDH 抗体4 ℃下孵育过夜后，以1∶5 000倍稀释的二抗室温孵育1 h；加入ECL显影，凝胶成像系统扫描分析，计算蛋白相对表达水平。

九、统计学分析

采用SPSS 22.0软件（IBM公司，美国）进行统计学分析，实验数据以均数±标准差（）表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间多重比较采用SNKq检验，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、转染后各组MG63细胞中miR-27b的表达

与模拟物对照组相比，miR-27b模拟物组MG63细胞中miR-27b的表达水平明显升高（P＜0.05）；与抑制剂对照组相比，miR-27b抑制剂组中miR-27b的表达水平降低（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞中miR-27b表达水平的比较（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

二、miR-27b对骨肉瘤MG63细胞增殖的影响

在24 h作用时间下，模拟物对照组、miR-27b模拟物组、抑制剂对照组和miR-27b 抑制剂组细胞增殖活力的差异无统计学意义（P＞0.05）。在48 h 和72 h作用时间下，miR-27b模拟物组细胞的增殖活力明显高于模拟物对照组（P＜0.05），而miR-27b抑制剂组细胞的增殖活性低于抑制剂对照组（P＜0.05）。见图2。

图2 miR-27b对骨肉瘤MG63细胞活性的影响（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

三、miR-27b对骨肉瘤MG63细胞侵袭和迁移的影响

与模拟物对照组相比，miR-27b模拟物组MG63细胞侵袭数和迁移MG63 细胞数明显增多（P＜0.05）；同时，miR-27b 抑制剂组中侵袭细胞数和迁移细胞数较抑制剂对照组明显减少（P＜0.05）。见图3。

图3 miR-27b对骨肉瘤MG63细胞侵袭（a）和迁移（b）的影响（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

四、miR-27b对骨肉瘤MG63细胞凋亡的影响

与模拟物对照组相比，miR-27b 模拟物组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；与抑制剂对照组相比，miR-27b 抑制剂组细胞凋亡率升高（P＜0.05）。见图4。

图4 流式细胞仪检测各组细胞凋亡结果（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

五、miR-27b靶基因的预测及验证

生物信息学软件预测结果显示，FOXO1 3’UTR与miR-27b有互补结合的核苷酸序列，见图5。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-27b 模拟物与野生型FOXO1 3’UTR 共转染的MG63 细胞荧光素酶活性降低；miR-27b 抑制剂与野生型FOXO1 3’UTR 共转染的MG63 细胞荧光素酶活性升高（P＜0.05）；但miR-27b 模拟物和miR-27b 抑制剂与突变型FOXO1 3’UTR 质粒转染的MG63 细胞荧光素酶活性的差异无统计学意义（P＞0.05）。miR-27b模拟物明显抑制MG63 细胞中FOXO1 蛋白的表达；而miR-27b 抑制剂则明显促进FOXO1 蛋白的表达（P＜0.05），见图6。

图5 FOXO1 3’-UTR 与miR-27b 互补结合位点（a）及荧光素酶活性检测（b）（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

图6 Western blot 检测FOXO1蛋白的表达（与模拟物对照组相比，*P＜0.05；与抑制剂对照组相比，#P＜0.05）

讨 论

miRNA 通过与靶mRNA 的3’UTR 结合从而降解或诱导翻译沉默，在调节细胞增殖、分化、凋亡和发育过程中发挥作用。多项研究表明，miRNAs 在骨肉瘤的诊断、治疗和预后中发挥重要作用［10］。miR-27家族是一种有多功能的miRNA，参与人类多种疾病的发生、发展［11］。miR-27b 是miR-27 家族成员，其在不同肿瘤中的作用不尽相同。在非小细胞肺癌和结肠癌中发现miR-27b 表达降低，而上调其表达可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭［12-13］。但是，miR-27b 在乳腺癌中表达升高，可通过靶向抑制丙酮酸脱氢酶蛋白X（PDHX）表达，解除细胞代谢，促进乳腺癌细胞增殖［14］；miR-27b 上调表达可促进宫颈癌细胞的增殖、侵袭［15］。本研究通过转染miR-27b 模拟物或抑制剂成功改变骨肉瘤MG63 细胞中miR-27b 的表达，发现miR-27b 过表达可显著增强MG63细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡抵抗作用；而miR-27b低表达则呈现出相反的效果。该研究结果与前面miR-27b 在宫颈癌和乳腺癌中的促癌作用相似。提示，miR-27b可能在骨肉瘤中发挥致癌作用。

FOXO1 属于FOXO 家族，是一种重要的转录因子，影响细胞的增殖、分化和凋亡等，且影响肿瘤的进展［16］。研究显示，FOXO1 在非小细胞肺癌、宫颈癌和胃癌等多种肿瘤中表达下调，在肿瘤发生、发展过程中发挥着抑癌因子的作用［17-19］。为了探讨miR-27b 调控骨肉瘤发生发展的分子机制，本研究进一步采用生物信息学软件预测miR-27b的潜在靶基因，结果将FOXO1作为研究对象。本研究采用双荧光素酶报告基因实验检测发现，miR-27b 模拟物可与FOXO1 3’UTR靶向结合降低细胞荧光素酶活性，而miR-27b 抑制剂则可升高其荧光素酶活性。同时，Western blot结果显示，miR-27b模拟物可降低FOXO1 蛋白的表达，而miR-27b 抑制剂则相反。结果表明，FOXO1 是miR-27b 的潜在靶基因，miR-27b可靶向调控其表达。已有研究证实FOXO1 在骨肉瘤中低表达，抑制其表达可促进细胞增殖和集落形成［20］；而上调FOXO1的表达可抑制骨肉瘤细胞的增殖并诱导细胞凋亡［21］。结果提示，在骨肉瘤发生、发展过程中，miR-27b 可能通过靶向调控FOXO1 表达促进肿瘤的恶性进展。

综上所述，miR-27b 可能通过靶向调控FOXO1在骨肉瘤MG63 细胞中促进细胞增殖、侵袭和迁移并抑制细胞凋亡。该结果有望为miR-27b成为骨肉瘤基因治疗提供参考依据。