吴海峰 李 曼 李玉静 江 乾 李 亮 赵世彬 乜照燕**

1. 河北省胸科医院检验科（河北石家庄 050021）；2. 河北医科大学第四医院生殖医学科（河北石家庄 050011）

过度氧化应激可以对精子细胞造成损伤，影响精子活力，导致精子DNA 完整性降低，影响男性生育力[1]。白藜芦醇（Resveratrol，RES）是一种天然多酚类物质，主要存在于虎杖、葡萄和红酒中[2]。RES 具有多种生物学活性如抗肿瘤、抗炎、抗氧化等[3]。RES 化学结构中存在酚羟基，具有抗氧化作用，可以清除过氧化物减轻细胞膜脂质过氧化和各种活性氧产物对细胞的损伤[4]。鉴于此，本研究利用过氧化氢（Hydrogen peroxide，H2O2）建立精子氧化应激损伤模型，探讨RES 对H2O2诱导精子氧化应激的保护作用，为男性不育抗氧化治疗提供依据。

材料和方法

一、试剂和仪器

Percoll 细胞分离液购自Solarbio 公司 （Lot. No.5111042）；白藜芦醇( VETEC，900386-5 G) 购自Vetec公司；伊红- 苯胺黑染液(20201201)、精子吖啶橙购自华康生物工程公司。离心机购自eppendorf 公司，相差显微镜购自Olympus 公司，荧光显微镜购自Olympus公司，酶标分析仪购自Biotek 公司。

二、精液收集和处理

收集2019 年12 月于河北医科大学第四医院生殖医学科精液常规检查正常精液标本。患者年龄25～32岁，平均年龄(29.0±2.4) 岁。所有样本均在禁欲2-7 天后通过手淫法收集，收集精液于干净容器后立即送精液检查室，在室温下放置30 min，待精液液化后，依据WHO 人类精液实验室检验手册第五版进行精液参数常规分析[5]，本项研究经我院伦理委员会批准（伦理编号：2020KSO29）。

三、H2O2 诱导精子毒性作用和RES 保护作用

取上述精液标本进行Percoll 密度梯度离心。具体操作如下：准备梯度液，40% Percoll 液1.5 ml+80% Percoll 液1.5 ml，将精液2 ml 缓慢加入15 ml 尖底离心管，1 200 r/min 离心15 min，弃上清，底层白色沉淀即为分离出精子。弃上清后底层精子加入2 ml 培养液，1 200 r/min 离心5 min，洗涤1 次后加入培养液调整精子浓度为20×106/ ml，处理后精液每份取0.1 ml，加入终浓度0、25、50、75、100 μmol/L H2O2置5% CO2，37℃培养箱继续培养24 h，每组设5 个标本，计数前向运动精子和总活力精子百分比，选择H2O2浓度建立精子氧化应激损伤模型。

选用不同浓度5、10、25、50、75 μmol/L RES 和上述三中确定H2O2浓度，置5% CO2，37 ℃培养箱共培养24 h，每组设5 个标本，计数精子前向运动和总活力精子百分比，确定RES 最佳改善浓度。

四、实验分组和各项相关指标测定

根据上述确立H2O2和RES 浓度将实验分为3 组：对照组(CON)：处理后精液不做处理，置5% CO2，37℃培养箱培养24 h；H2O2模型组(H2O2)： 加入H2O2（H2O2浓度按三确定），置5% CO2，37℃培养箱培养24 h；RES+H2O2改善组(RES+H2O2)，加入H2O2和RES（H2O2和RES 浓度按三确定），5% CO2，37℃培养箱培养24 h；待处理后检测各组精子膜完整性、精子氧化应激产物MDA 和精子DNA 损伤。

（一）伊红- 苯胺黑法评估精子膜完整性

使用移液器吸取10 μl 各组精液样本于干净EP管，加入10 μl 伊红- 苯胺黑溶液在EP 管内充分搅拌混匀，放置60 s。滴加上述精液和伊红- 苯胺黑染色液混合液10 μl 于载玻片上，制成涂片，自然干燥后100×油镜下观察。使用血细胞计数器来计数染色（精子膜不完整，淡红色）和不染色（精子膜完整，白色）细胞数目。为了降低误差，每张玻片评估200 个精子。

（二）氧化应激指标丙二醛测定

精子膜脂类过氧化反应的程度一般用氧化应激反应产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)表示，MDA 测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法，本研究采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒(KGT004-1)测定。测定管为0.1 ml 取待测精液，按照说明书操作设空白管、标准管及标准空白管，分别加入相应试剂，450 nm 处BioTek 酶标仪测定。结果用nmol/ml 表示。

（三）精子DNA 损伤测定

采用精子吖啶橙(acridine orange，AO) 染色法，取10 μl 各组精子凃片，室温自然晾干后甲醇固定。AO 染液新鲜配制，染色5 min 后缓慢流水冲洗，室温干燥后用荧光显微镜于×400 观察，激发滤光片使用波长460～490 nm，快速计数，每个视野下观察时间不超过40 s。每个样本观察计数不少于10 个视野。判断标准：正常精子为正常双链DNA，呈绿色，损伤精子呈红色或黄色。计数200 条精子中绿色(G)、红色(R)和黄色(Y)精子数，计算出DNA 完整精子百分率。

五、统计学方法

用Excel 表格录入数据，采用双录入法核实无误后，将数据应用SPSS21.0 软件进行统计学处理，计量资料数据用均数±标准差x±s表示，均值比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 法，以P＜0.05 表示组间比较差异具有统计学意义。

结 果

一、H2O2 导致精子前向运动精子和总活力下降

不同浓度H2O20、25、50、75、100 μmol/L 处理后，结果显示：与对照组比较，随着H2O2浓度增加，精子前向运动和总活力随着H2O2浓度增加逐渐降低，呈剂量依赖关系。与未加H2O2组相比，50、75、100 μmol/L 差异有统计学意义（P＜0.05，表1），选择100 μmol/L 为后续实验药物浓度。

表1 H2O2 对处理后精子前向运动和总活力影响(x±s)

二、RES 改善H2O2 导致精子活力下降

加入不同浓度RES 和H2O2共同作用后，结果显示：随着RES 浓度增加，精子前向运动和总活力百分比逐渐增加，RES 浓度50 μmol/L 时，精子前向运动和总活力逐渐增加，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示RES预处理对H2O2损伤后精子活力有改善作用。在RES 浓度50 μmol/L 效果最佳。选择50.0 μmol/L 为后续实验药物浓度（P＜0.05），见表2。

表2 RES 预处理对H2O2 诱导处理对精子前向运动和总活力影响(x±s)

三、RES 改善H2O2 导致精子氧化应激、精子膜完整性改变和精子DNA 完整性

与RES+H2O2相比，H2O2组MDA 水平增高，精子膜完整性百分比降低，精子DNA 完整性百分比降低，结果均有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 RES 预处理对H2O2 诱导精子氧化应激水平影响(x±s)

讨 论

活性氧(reactive oxygen species, ROS)是机体正常有氧代谢的中间产物，在正常条件下，机体保持氧化与抗氧化系统平衡，当机体遭受各种内外环境有害刺激时，机体可产生氧化和抗氧化系统失衡，发生氧化应激损伤。氧化应激损伤可以造成精子结构和精子功能损害，是引起男性不育病因之一[6]。男性不育与其精浆中活性氧水平密切相关，过量活性氧会对精子细胞膜和精子DNA 造成严重的氧化损伤，从而引起精子膜脂质、超微结构损伤，导致精子运动能力下降[7]。此外，在辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）精子优选过程多次离心会刺激精子产生大量ROS 诱发氧化应激。因此如何防范氧化应激导致男性生育力降低和减少离心过程中过量ROS 生成，对改善男性精子水平和提高ART 妊娠结局意义重大。目前应用抗氧化剂主要有维生素C、维生素E、辅酶Q10、虾青素等，这些人工合成抗氧化剂具有相对分子质量大、不易吸收的缺点。因此我们需要寻找一种新的天然的、无生物危害、易于吸收抗氧化剂，以保护精子免受氧化应激损伤。

RES 是在葡萄皮、虎杖等植物提取到的非黄酮类多酚化合物，分子式C12H14O3，分子质量228.25ku，它在葡萄籽提取物、葡萄汁和葡萄皮中含量丰富。目前，以其来源广泛、高效、低毒等特性受到研究者重视。RES能有效清除过氧化物和羟基，具有强大抗氧化作用，防止氧化应激对细胞造成损伤[8]。RES 能够激活体内抗氧化酶系统超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）等，具有细胞内抗氧化活性[9]。另外研究发现RES 具有增强细胞抗氧化功能，可以保护细胞免受氧化应激损伤而减少细胞死亡[10]。RES在人类心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病等发挥重要作用[11]，但在精子方面作用研究较少。

故本研究建立了H2O2诱导精子氧化应激模型，探讨了白藜芦醇对H2O2诱导精子氧化应激模型的保护作用。本研究所用精子为处理后精子，经过梯度离心处理，精子前向运动精子一般都在90%以上。

有研究认为精子运动是精子氧化应激损伤最早而且最敏感的指标[12]。本研究结果显示，H2O2添加抑制精子活力。随H2O2浓度增加精子活力不断下降，在100 μmo1/L 精子活力下降最明显，由于精液计数存在一定误差，本研究选用了一个使前向运动精子和精子总活力下降最大浓度100 μmo1/L H2O2作为精子氧化应激模型研究浓度。在RES+H2O2组，随着RES 浓度升高，精子前向运动和总活力百分比得到提升，这一结果提示我们，适宜浓度RES 可提高H2O2诱导精子活力下降，其中50 μmol/L RES 浓度效果最佳，故选择50.0 μmol/L 为后续实验中最佳浓度。此外，研究还发现75 μmol/LRES 精子前向运动百分比和总活力百分比有稍微下降，是否RES 在高浓度会对精子活力产生抑制作用尚需进一步研究。

精子膜表面富含多聚不饱和脂肪酸，容易受到氧化应激攻击，使精子膜结构发生损伤进而影响精子活力和功能。RES 作为一种自由基清除剂，能有效地与脂质双分子层中的自由基相互作用，并增强过膜流动性，稳定膜结构[13]，本研究显示，H2O2处理后，导致精子膜完整性降低，RES 处理显著抑制了H2O2诱导精子膜完整性降低，由此可见，RES 具有稳定精子细胞膜作用。

精子细胞质含量少，含有清除作用的细胞质内抗氧化酶含量低，对活性氧诱导的损伤极为敏感[14]。MDA 是氧化应激损伤过程中产生的主要产物之一，对精子细胞有明显损伤作用，是引起不育常见代谢产物[15]。本研究显示，H2O2处理后，MDA 明显升高。与对照组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。RES 加入抑制了H2O2诱导MDA产生，由此可见RES 添加抑制了H2O2诱导ROS 产生。

此外，精子DNA 完整性对于受精及胚胎发育是十分重要。本研究结果显示H2O2处理后，精子DNA 损伤增加。精子DNA 外包被有鱼精蛋白，染色质状态高度致密，过量ROS 可以与DNA 亲核基团反应，导致DNA链聚集并改变DNA 正常结构。有研究显示氧化应激造可成精子核结构损伤，破坏DNA 双链结构，精子DNA碎片化指数升高[16-17]。本研究显示RES 加入显著降低了H2O2诱导精子DNA 损伤升高。这可能与RES 降低氧化应激产物水平，避免了活性氧对精子的攻击有关。已有研究证实精液冷冻保护液中添加RES 可以通过降低精子内ROS 水平，减少精子冷冻损伤，从而改善解冻后精子质量[18]。亦有研究证实RES 改善了弱精子症患者精子活力、精浆锌含量、精浆硬弹性蛋白酶以及精子顶体酶活性，推测可能与RES 的抗氧化作用有关[19]。此外，RES 可以减少化疗药物导致的精子氧化应激水平增加，能预防和缓解化疗药物对人精子造成的损伤[20]。

综上所述，本研究证实RES 通过抗氧化改善了H2O2诱导的精子损伤。这一作用可能与白藜芦醇抗氧化作用有关，其作用机制也是我们下一步研究的重点。未来研究将进一步阐明RES 改善氧化应激对精子的损害的机制和RES 应用安全性问题。由于RES 具有多种有益于人类健康的生物药理活性，使其广泛应用于医药、保健品和食品添加剂等领域。其在肿瘤、心脑血管疾病、炎症等方面的治疗及预防作用也越来越被人们认可，RES 临床应用前景广阔，有望成为一种男科领域抗氧化的新型药物。