赵万乐，朱松波，李艳玲,杨玉荣,陈二平

（郑州市农林科学研究所，河南 郑州 450005）

分离X、Y精子，用于人工授精，是目前畜牧业生产中实现性别控制的重要手段。由于X 精子和Y 精子所携带的性染色体不同，这2种类型的精子之间就必然存在着某些性状差异，这就使得利用某种相应方法把它们分离开来成为可能，但须保证分离操作不使特定类型精子的受精力受到损害。

1 X、Y精子分离的生物学基础

多年来，人们几乎都是利用X、Y 精子之间的某些差异来分离不同类型的精子。如检查Y精子上的F小体、区别X、Y精子头部大小、X、Y精子的重量及比重上的差异、精子外膜电荷上的差异、抗原性的差异及耐酸碱性上的差异等等（见下表）。

到目前为止，除X、Y 精子的DNA 含量的差异可以肯定之外，其他方面的差异甚微或者难以确切地证明，此外，这些差异还常常随各种环境条件的不同而变化。因此，对两类精子某些差异的研究还存在着争议。

2 X、Y精子分离方法及研究进展

目前已有诸多关于X、Y 精子分离技术的报道，如密度梯度离心法、电泳法、流式细胞分选法等。

2.1 白蛋白梯度游动分离法

该方法的原理基础是：Y 精子的体积比X 精子小，并且在高密度的人血清白蛋白液柱中向下游动的速度比较快，通过丢弃白蛋白柱上层，收集底部22%的部分而得到富集Y精子液体。

然而，这种精子分离方法一直以来不断受到质疑，而且从来没有在除了人类以外的哺乳动物上获得成功。再者，这一方法只能纯化Y精子群，不能得到X精子群，这势必会影响其推广和应用。

2.2 自由电泳分离法［2］

自由电泳分离法是根据X 精子和Y 精子的表面电荷可能存在差别的原理，将精子放入特制的电泳容器，加以一定持续电场，使得两种电荷量不同的精子朝着不同的路径泳动而得以分离。

应用该方法进行人类精子的分离试验时，用F检验分析表明，分离得到的X 精子样本相对纯度高一些，而Y 精子纯度就比较差，但是分离后的精子受到了很大的影响，活力大大降低。况且，不同实验室用该方法得到的结果不尽相同甚至相反，有的认为是X精子表面携带的负电荷比较多，电泳过程中将会趋向阳极。有关专家认为，试验结果的差异可能是由于精子成熟过程或活力变化时其表面电荷会随之改变所导致的。

表 X精子和Y精子的差异比较［1］

2.3 离心沉积分离法［3］

在一定的溶液中，X 精子的沉降速率比Y 精子快。在国内，曹世祯等［3］报道利用Percoll 梯度进行精子分离，分离后用富含Y 精子的精液人工授精所生产的后代雌雄比例为4 613∶5 317；利用富含X 精子的精液人工授精所生产的后代雌雄比例为6 514∶3 416。为什么X精子的沉降速率比Y 精子稍快呢？有关专家认为，这是因为X 精子和Y 精子之间重心的差异促使X 精子更容易通过各个密度梯度之间的界面。该方法分离得到的X、Y 精子的结果不稳定，缺乏重复性，不同的实验室得到不一致的结果，甚至还有人用同样的方法分离不开X 精子和Y 精子。

2.4 精子体积差异分离法

该方法依据X 精子体积比Y 精子体积要大的原理。该方法吸引人之处在于进行精子分离时不需要DNA 染料。但是该方法实际分离并没有达到理论预计的效果，X精子或Y精子分离纯度都没有达到80%以上。

2.5 精子差异膜蛋白分离方法［4］

这些技术手段主要有二维电泳、高效液相色谱、蛋白质芯片等。这些技术的产生和发展为分离和鉴别X、Y 精子间细微差异膜蛋白提供了新的技术方法。

2.6 流式细胞仪分离法

用流式细胞分离仪分离哺乳动物X、Y精子的性别控制技术，是根据哺乳动物X 精子的DNA 含量比Y 精子多的原理，利用特异性荧光染料将精子的DNA染色，然后通过流式细胞仪将X精子和Y精子分离，并通过人工授精或体外受精等技术，按人们的愿望使雌性动物繁殖出所需性别后代的一种繁殖新技术。目前，流式细胞仪精子分离技术已经成为科学、可靠、高效的性别控制方法之一，但此技术成本高，在畜牧业生产中推广受限。

2.7 H-Y抗原免疫法

利用免疫学方法分离精子是从发现H-Y抗原后逐渐发展起来的。经研究，H-Y抗原特异表达于Y精子细胞膜上。因而，利用H-Y抗体检测质膜上存在的H-Y抗原，再通过一定的分离程序，就可以将精子分离成为Y精子和X精子两类。然而，研究者在用抗H-Y 抗原抗体对流式细胞仪精确分离出来的精子样品进行分析后发现，不仅是Y精子，X精子也能结合抗H-Y抗原抗体。因此，在本质上X、Y精子之间会共享抗原，利用免疫手段分离X、Y精子在现有的技术条件下还很难取得实质性进展。

3 X、Y精子分离后的应用效果［5］

3.1 精子分离的效果

流式细胞分选法是目前比较成功的分离X、Y精子的方法，可以获得纯度较高的单一精子。例如分离人精子时，X 精子的分离纯度可达80%～90%，Y 精子的分离纯度可达60%～70%；分离猪和牛的精子时，其纯度达85%～98%。

3.2 精子分离后的人工授精（AI）

在提高家畜品种改良效率和增加优良种畜后代数量的各种技术中，Al最具影响力，Al技术与精子分离技术将对畜牧业生产产生无法估量的作用。据有关报道，冷冻分离精子的授精剂量为100 万～150 万个精子与300 万个精子的妊娠率没有差异，用X精子授精后所产犊牛的性别准确率为83%，Y 精子为90%，并且犊牛的生长发育没有任何异常现象。在猪、马和羊方面，运用分离精子进行Al都有成功报道。

4 展望

综上所述，在各种精子分离方法中，免疫学方法与流式细胞仪分离法具有巨大的发展潜力与广泛的应用前景，可以相信，随着研究的深入，更加快速简便、准确率高、费用低且可以用于大规模生产的精子分离是可以实现的。

从根本上讲，控制动物性别最理想的方法是先分离X、Y精子，再采用相应性别的精子进行人工授精或体外受精，得到所需性别的后代。随着科技的进步、先进仪器的诞生，人类将最终实现按需要自由控制家畜性别的梦想。