韩小克 杨惠祥 李维钏 杨志伟 苑 辉 赵晓丹 李 慧 戴芳芳 郑 波

邢台不孕不育专科医院（河北邢台 054000）

根据《世界卫生组织男性不育标准化检查与诊疗手册》的病因分类，男性不育可分为17 种病因，其中由遗传异常引起的染色体异常较已育男性高8~10 倍[1]。染色体结构异常的生殖细胞进行减数分裂会导致精子生成障碍、精子遗传物质异常，从而影响妊娠结局。在选择生育策略时面临如下几种伦理困境：尝试自然怀孕，自然流产风险高；接受产前诊断可能面临终止妊娠的决定；接受胚胎植入前遗传学检测（PGT），其标本取样和诊断技术仍然存在某些局限性和缺陷，费用相对昂贵[2]。不同类型染色体结构异常的生殖细胞进行减数分裂时，形成正常精子的比例不同，研究染色体异常的携带者在减数分裂中形成的配子类型，尤其是正常或平衡型精子所占比例，可为遗传咨询、生育指导提供信息。

对象和方法

一、研究对象

选择2019 年1 月至2021 年6 月期间就诊于邢台不孕不育专科医院并经外周血染色体核型分析确诊的7 例染色体结构异常的男性患者，详见表1。对照组选择同期就诊于本院染色体正常的不育男性（对照组1）和染色体正常的生育男性（对照组2）。所有患者均知情同意并经过医院伦理委员会讨论通过。

表1 7 例染色体异常患者病例资料

二、方法

（一）精液分析

禁欲2-7 天，手淫法获取新鲜精液于洁净容器内，放置于37。C 水浴恒温箱内液化。精液液化后取10 μL涂片，以伟力精子检测系统行精液分析，所有操作严格参照世界卫生组织《人类精液检查与处理实验室手册》第5 版标准执行，分别记录精子浓度、前向运动精子。

（二）染色体核型分析

采集外周血淋巴细胞培养72 小时后，采用G 显带技术进行染色体制备，GLS-120 全自动分析仪扫片后，计数20 组，分析5 个核型。按人类细胞学国际命名体制（ISCN2016）进行染色体核型分析和命名。

（三）染色体探针

美国Vysis 公司生产的染色体特定位点DNA 序列特异性的荧光素标记探针。包括：1-22 号、X、Y 染色体着丝粒探针（CEP），1-22 号染色体长臂亚端粒探针（Tel q），1-12 号染色体短臂亚端粒探针（Tel p），基因特异性探针LSI13q14。

（四）检测方法荧光原位杂交技术（FISH）

制片：精液样本液化后，取1-2 mL 移入离心管中与7 mL 1×PBS 溶液混匀洗涤，1500 转/ 分钟离心10 分钟，弃上清，加适量1×PBS(约0.2-1 mL)重悬沉淀，制备精子悬液。取100 uL 精子悬液均匀分散在载波片上，室温风干后在卡洛氏固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）浸泡10分钟，取出玻片风干后放入0.05M 流苏二糖醇（DTT）溶液中，处理10 分钟后取出，依次放入75%酒精、90%酒精、100%酒精梯度脱水各2 分钟，60℃烤片1 小时，用0.1μg/uL RNA 酶溶液于37℃处理玻片标本区30 分钟，酒精梯度脱水风干后将载玻片放入75℃水浴预热的变性液中变性5 分钟，75%、90%、100%酒精梯度脱水各2 分钟，室温风干玻片。

杂交：按照说明书配制探针组合液，取5 uL 探针液于75℃水浴变性5 分钟，将5 uL 已变性探针滴加到载玻片标本区并用蜡膜封片，载玻片放入湿盒中于37℃恒温箱中杂交16 小时，杂交完成后用高盐缓冲液洗脱去除背景和多余的探针液，75%、90%、100%酒精梯度脱水各2 分钟，室温风干玻片，滴加10 uL DAPI复染液（0.5mg/mL）在标本区并盖上盖玻片于暗处放置10 分钟，通过FISH2.1 软件用荧光显微镜在40 倍物镜下拍照，每种探针根据染料颜色使用对应的虑色块通道拍照，最后保存不同颜色组合探针荧光信号的叠加图。

分析：在FISH 软件中分析计数每个精子核中每种探针的荧光信号数。同一个精子核中每个探针信号均1个时，判断为正常信号即染色体正常和（或）平衡型精子，否则为异常信号。对正常/ 平衡型精子、不平衡精子计数，计算正常/ 平衡型精子所占比例。

两轮杂交操作中，进行第二轮杂交前充分曝光淬灭第一轮的杂交信号，且第二轮杂交信号计数分析是通过相同的坐标寻找到与第一轮相同区域的视野拍照保存图片，并与第一轮保存的图片对比分析进行荧光信号计数，避免第一轮杂交信号对第二轮杂交信号分析计数的影响。

（五）统计学分析

数据采用SPSS17.0 软件进行处理，数据采用率(%)表示，组间数据比较通过χ2检验, 以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

一、精子FISH 结果

所有探针杂交率均在95%以上，荧光显微镜下精子FISH 结果，详见图1，图2，图3，图4。病例1、病例2、病例3、病例4、病例5 正常和（或）平衡型精子率分别为27.98%（61/218）、28.94%（101/349）、40.26%（213/529）、25.71%（54/210）、34.10%（148/434）；复杂结构异常的病例6 正常和（或）平衡型精子率为10.95%（23/210）；罗伯逊易位病例7 正常和（或）平衡型精子率为85.77%（1 079/1 258）。染色体正常的不育男性组（对照组1）正常和（或）平衡型精子率为99.86%（13 232/13 250），染色体正常的生育男性组（对照组2）正常和（或）平衡型精子率为99.74%（12 346/12 378）。病例1 至病例7 与对照组比较，差异均具有统计学意义（P＜0.05），详见表2。

表2 精子染色体FISH 结果

图1 病例1 46,XY,t(1;3)(p32;p13) 精子FISH 结果

图2 病例3 46,XY,t(2;14)(q33;q13)精子FISH 结果

图3 病例6 46,XY,inv(4)(p14q33),t(6;14)(p21;q24) 精子FISH 结果

图4 病例7 45,XY,der(13;14)(q10;q10) 精子FISH 结果

I 表示第一轮探针FISH 检测，应用1 号染色体短臂亚端粒探针（Tel 1p，绿色信号）和1 号染色体长臂亚端粒探针（Tel 1q，红色信号）组合检测；II 表示第二轮探针FISH 检测，应用3 号染色体短臂亚端粒探针（Tel 3p，绿色信号）进行检测。同一个精子核中每个探针信号均1个时，判断为正常信号，否则为异常信号。

讨 论

染色体异常包括染色体数量异常和结构异常，染色体数目异常如21- 三体综合征（47,XY,+21）、克氏综合征（47,XXY）、超雄综合征（47，XYY）等。染色体结构异常是染色体发生断裂后重新连接的结果[3]，根据断裂的部位、数目、受累染色体以及重连方式的不同，可分为易位（相互易位、罗氏易位）、倒位、Y 染色体微缺失和端粒长度异常等。

染色体平衡易位是最常见的一种染色体结构异常，主要有相互易位、罗伯逊易位、复杂易位等；其中相互易位在群体中的发生率约为1/1 000-1/500，不育人群中的发生率为0.6%，无精子或少精子症男性的染色体平衡易位的发生率为1.4%，在反复自然流产的人群中高达6.2%[4-5]。相互易位携带者自身可无表型，但在减数分裂中易位染色体及其同源染色体互相配对发生遗传物质的交换，最后分离进入子细胞[6]，其分离方式包括2:2 对位分离、2:2 邻近-1 分离、2:2 邻近-2 分离、3:1 分离和4:0 分离等5 种，理论上可形成18 种类型的配子，其中1 种正常,1 种为平衡型易位，其余16 种均具有某一条染色体的重复或缺失。罗氏易位携带者在进行重组分离时可形成6 种类型的配子，其中1 种正常,1 种为平衡易位，其他4 种均为重复或缺失的不平衡配子[7]。这些是导致胚胎发育延迟、自然流产、胚胎停止发育、新生儿死亡、胎儿畸形及智力低下等的主要原因[8-10]。本研究通过荧光信号将染色体平衡型精子与不平衡精子进行区分，5 例相互易位病例平衡型精子率分别为27.98% （61/218）、28.94% （101/349）、40.26% （213/529）、25.71%（54/210)和34.10%（148/434)，1 例复杂结构异常病例平衡型精子率为10.95%（23/210)，1 例罗氏易位病例平衡型精子率为85.77%（1 079/1 258)，可见实际观察到的染色体平衡型精子比例均明显高于理论值，相关研究亦得出相似的结论[11]。Flynn 等[12]报道：在生育方面，经历多次流产的男性平衡易位携带者累积活产率可达64.3%。根据平衡易位（相互易位、罗伯逊易位）携带者配子分离规律形成的配子类型，推测其生育染色体正常或平衡易位后代的理论概率，并不能得到临床数据的支持[11]。上述染色体异常的病例其正常和（或）平衡型精子所占比例远远高于根据分离模式推测的理论概率，推测其可能机制为携带者产生的不平衡精子在减数分裂的过程中导致精母细胞凋亡，或异常的精子在精子发生过程中被清除，其具体机制仍需进一步研究。

染色体平衡易位携带者可选择自然受孕或通过辅助生殖技术帮助其妊娠，在孕中期行产前诊断来获取后代是完全可行的，但一定要让患者充分了解不同生育方式的优缺点以及需要承担的风险，同时明确产前诊断的重要性，做到知情选择。随着细胞及分子遗传学诊断技术的发展，目前平衡易位患者多建议通过胚胎植入前遗传学检测（PGT）技术在胚胎植入女方宫腔前排除异常的胚胎[13]，但无论是胚胎植入前遗传学检测(PGT)，还是产前诊断都只是在检测的时间节点上提前，并不能实质性的提高正常胚胎和胎儿的形成。染色体平衡易位的男性如可通过选择精子的方式，在精卵结合之前即选择染色体正常的精子，那么获得更高概率的良好妊娠结局便成为可能，但如何选择染色体正常的精子亟待解决。

综上，通过荧光原位杂交技术（FISH）检测染色体结构异常患者的精子染色体, 可为生育指导提供初步的客观依据。限于样本数较少，需进一步扩充样本量、染色体异常类型，深化精子全染色体组的检测，在更广的范围为生育指导提供更充分的依据。