余海洋 梅峻豪 秦立昊 刘纯 周熠 赵红斌 李辰凯 贾中芝

慢性创面的修复一直是临床亟待解决的难题，需要一种经济实惠、有量产前景的人工皮肤[1]。近年来，3D打印技术逐渐应用于人工皮肤支架的制备，而使用该技术将海藻酸钠(Sodium alginate，SA)和明胶制成不同规格的皮肤支架的研究较少[2]。本研究采用RegenHU 3D生物打印机，制备不同规格的SA-明胶皮肤支架，并对其生物相容性及对大鼠皮肤成纤维细胞生物学行为的影响进行评价，试图为慢性创面的修复提供一种可降解的3D打印皮肤。

1 材料和方法

1.1 实验材料与仪器

大鼠皮肤成纤维细胞(中科院细胞库)。SA和明胶(麦克林生化科技有限公司)；无血清细胞冻存液(苏州新赛美生物科技有限公司)；Live/Dead试剂盒(Invitrogen，美国)；羟脯氨酸检测试剂盒(南京建成生物研究所)；大鼠白介素6酶联免疫分析试剂盒(武汉酶免生物科技有限公司)。

1.2 SA-明胶皮肤支架的制备

按照SA的质量百分比制成不同规格的SA-明胶皮肤支架。分别将质量百分比为3%、4%、5%的SA粉末与去离子水加入装有明胶颗粒的烧杯中，40 ℃水浴电磁搅拌2 h，充分混匀后置于37 ℃备用。使用3D打印机配套BioCAD软件设计模型：15 mm×15 mm，厚度4层，间距0.8 mm。将SA和明胶原料放入热熔针筒中，针筒加热至40 ℃，调节温度为37 ℃恒温，气压0.25 MPa，距离2 mm，打印速度6 mm/s，针头25 G，分别打印3%、4%、5%的SA-明胶皮肤支架。

1.3 SA-明胶皮肤支架的表征

利用扫描电镜观察皮肤支架表面形貌，比较不同规格的SA-明胶皮肤支架的表面形貌特征。

1.4 大鼠皮肤成纤维(RS1s)细胞的培养

将复苏后的大鼠RS1s细胞移入25 mL培养瓶中，加入10 mL含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM basic完全培养基，放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中进行培养，每隔2 d换液，待细胞贴壁生长至85%时，胰酶消化并传代。

1.5 生物相容性检测

将皮肤支架置于12孔板内，孔内加入2 mL DMEM basic完全培养基，将大鼠RS1s细胞以1×105/孔的密度接种于12孔板内，与皮肤支架共培养2 d后，使用Live/Dead染色，倒置荧光显微镜下观察材料表面细胞黏附情况；与材料共培养5 d后，扫描电镜观察材料表面细胞的黏附和生长情况。材料置于12孔板内，将大鼠RS1s细胞以1×104个/孔的密度接种于12孔板内，分别与材料共培养1、3和5 d，加入CCK-8，检测细胞增殖情况。

1.6 胶原蛋白表达量的检测

材料置于12孔板内，将大鼠RS1s细胞以4×104个/孔的密度接种于12孔板内，分别与材料共培养1、2和3 d后，使用羟脯氨酸试剂盒检测胶原蛋白的含量(胶原蛋白的主要成分为羟脯氨酸)，细胞培养上清经过消化液充分消化后，使用酶标仪在550 nm波长下检测光密度(OD)值。羟脯氨酸含量=(测定管OD-空白管OD)/(标准管OD-测定管OD)×标准品浓度×稀释倍数。

1.7 IL-6表达水平检测

材料置于12孔板内，将大鼠RS1s细胞以4×104个/孔的密度接种于12孔板内，分别与材料共培养1、2和3 d后，使用大鼠白介素6酶联免疫分析试剂盒测定IL-6表达水平，使用酶标仪在450 nm波长下检测OD值，根据标准曲线查出OD值对应浓度后乘以稀释倍数，最终得到IL-6表达水平。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 皮肤支架的宏观与微观结构

肉眼观：3组皮肤支架呈网格状，孔径均匀(图1)。扫描电镜：3组皮肤支架均为多孔网状立体结构，孔隙均匀；3%SA组皮肤支架的表面较另2组明显粗糙(图2)。

图1 不同规格SA-明胶皮肤支架的大体观Fig.1 General view of different SA-Gelatin skin scaffolds

图2 扫描电镜下不同规格SA-明胶皮肤支架的表面形貌(A1-C1：80×；A2-C2：500×)Fig. 2 Surface morphologies of SA-Gelatin skin scaffolds with different specifications under scanning electron microscopy (A1-C1: 80×; A2-C2: 500×)

2.2 皮肤支架的细胞黏附与增殖

Live/Dead染色：细胞与皮肤支架共培养2 d后，在各组皮肤支架表面均能较好地黏附与生长，其中5%SA组细胞数量少于另2组；扫描电镜：细胞与皮肤支架共培养5 d时，细胞能在材料表面黏附与生长，其中4%SA组细胞数量多于另2组(图3)。

所有的电器元器件都具有适用的期限，如果在超过期限的情况下使用，必然会对工程机械电气设备的性能产生不利的影响，这同样也是不可避免的情况。特别是电机与变压器使用超过了期限，加之工作环境条件不理想，导致其绝缘性能受到不利的影响。交流接触器、继电器以及电位器在长期使用以后也会出现触头电接触不理想的情况。

A1-C1：扫描电镜观察(5 000×)；A2-C2：Live/Dead染色(40×)；A3-C3：Live/Dead染色(100×)；绿色：活细胞；红色：死细胞。A1-C1: Scanning electron microscope observation (5 000×); A2-C2: Live/Dead staining (40×); A3-C3: Live/Dead staining (100×); Green: living cells; Red: Dead cells.图3 大鼠皮肤成纤维细胞在3组皮肤支架表面的生长情况Fig.3 Growth of rat epithelial fibroblasts on the surface of skin scaffolds in three groups

CCK-8检测：如图4所示，在细胞与皮肤支架共培养1、3和5 d时，4%SA组细胞增殖率显著高于另2组，且差异均具有统计学意义(P<0.05)，第1天与第5天时3%SA组与5%SA组细胞增殖率无明显差异(P>0.05)。

图4 各组细胞与皮肤支架共培养1、3和5 d的增殖情况Fig. 4 Proliferation of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 3 and 5 days

2.3 皮肤支架对细胞胶原蛋白分泌的影响

图5显示，细胞与皮肤支架共培养1、2和3 d时，4%SA组胶原蛋白分泌量显著高于3%SA与5%SA组(P<0.05)，第1、2和3 d时3%SA组与5%SA组胶原蛋白分泌量无明显差异(P>0.05)。

图5 各组细胞与皮肤支架共培养1、2和3 d时的羟脯氨酸分泌水平Fig.5 Hydroxyproline secretion levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

2.4 皮肤支架对细胞IL-6分泌的影响

如图6所示，细胞与皮肤支架共培养1、2和3 d时，4%SA组IL-6表达水平显著低于3%SA与5%SA组(P<0.05)，第1、2和3 d 时3%SA组与5%SA组IL-6表达水平无明显差异(P>0.05)。

图6 各组细胞与皮肤支架共培养1、2和3 d时的IL-6表达水平Fig. 6 IL-6 expression levels of cells in each group after co-cultured with skin scaffolds for 1, 2 and 3 days

3 讨论

随着我国人口老龄化日益严重，慢性创面患者逐年增多，如糖尿病足溃疡患者等，慢性创面的救治已经成为临床上棘手的难题[3-5]。人工皮肤在慢性创面的救治过程中发挥着关键的作用[6-8]。随着3D打印技术的快速发展，3D打印人工皮肤支架逐渐走进人们的视野，虽然目前已有3D打印皮肤支架的相关[9-10]，但对3D打印皮肤支架的研究仍处于起始阶段，仍需展开相关的基础与临床研究。

3D打印皮肤支架的关键是生物墨水的选择，即材料的选择。目前最常用于人工皮肤支架的生物材料包括海藻酸盐、明胶、胶原蛋白、壳聚糖等，以上材料各有优缺点[2]。本研究采用了SA和明胶，SA是一种天然多糖，具有较高的稳定性、溶解性、黏性和安全性等[11]。明胶是一种大分子的亲水胶体，具有较高的生物相容性和生物可降解性，在体内降解后不产生副产物、无免疫原性，并具有与胶原相同的组分和生物性质[12]。本研究初步发现：SA和明胶能够制成理想的生物墨水，并具有较好的3D打印性能，打印出的SA-明胶皮肤支架在宏观和微观上能够满足临床使用需求。

在外观形貌方面，本研究按照SA的质量百分比制成了不同规格的SA-明胶皮肤支架，虽然3组皮肤支架在宏观上差别不大，均呈网格状，并且孔径均匀，但在微观结构上，3组皮肤支架存在较大的差异，尤其是3%SA组的皮肤支架，表面较另2组明显粗糙，这与SA的质量百分比不同直接相关。

不同的微观形貌，会对细胞的黏附与生长产生一定的影响。因此，在生物相容性方面，虽然细胞在3组皮肤支架表面均能较好地黏附与生长，但4%SA组较另2组更适宜细胞的生长。另外，我们还发现3组皮肤支架均对大鼠皮肤成纤维细胞的生物学行为有一定的影响，4%SA组羟脯氨酸分泌量显著高于另2组，这与前面证实的4%SA组更适宜细胞生长的结果一致。羟脯氨酸是构成结缔组织中胶原纤维的主要成分[13]，可以促进创面的修复。因此，4%SA组皮肤支架具有较高的生物相容性，且有利于创面的修复。

IL-6是活化的T细胞和成纤维细胞产生的淋巴因子，作为促炎细胞因子在体内炎症反应过程中发挥着重要的作用[14]。本研究初步发现4%SA组皮肤支架的IL-6表达水平显著低于另外两组，说明4%SA组皮肤支架在一定程度上抑制了IL-6的表达，从而抑制支架局部的炎症反应程度，最终加快创面的修复。

本研究不足之处：①仅进行了体外试验研究，未进行体内试验验证，下一步我们将开展动物实验来验证4%SA组皮肤支架对慢性创面愈合的作用；②扫描电镜下观察皮肤支架上的细胞数量明显减少，这可能与皮肤支架的脱水处理导致细胞脱落有关；③该皮肤支架的降解时间曲线仍需进一步验证。

综上所述，本实验利用3D挤压式打印成功构建了不同规格的SA-明胶皮肤支架，并初步证明了4%SA-明胶的皮肤支架具有较好的生物相容性和胶原蛋白分泌效应，并有效抑制炎症反应的发生，有望为创面修复提供一种可降解的3D打印皮肤支架。