孙志博，马中希，叶志伟，刘珍星，杨钟华，张山锋*

（1.武汉大学人民医院骨科，湖北武汉 430060；2.武汉市第四医院、华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科，湖北武汉 430034）

1 资料与方法

1.1 BMSCs分离

在获得患者知情同意与医院伦理委员会的批准后，在2018年8月—2019年12月选取因GC-ON⁃FH行全髋关节置换术的16例患者，GC-ONFH患者的纳入标准为：服用糖皮质激素≥1 800 mg，时间≥4周。其中8例男性，8例女性，年龄61～69岁，平均（64.35±5.17）岁；和16例股骨颈骨折患者，7例男性，9例女性，年龄59～73岁；平均（67.25±6.32）岁。术中抽取股骨骨髓5 ml，将其缓慢倒入含等体积淋巴细胞分离液的离心管中，将离心获得白膜层的单个核细胞置于另一离心管内，用完全培养基悬浮并调整细胞密度，按一定密度接种，记作原代。每两天换液，细胞达90%融合时消化，按1∶2比例传代。

1.2 实验分组与基因转染

实验分4组，每组5例：A组（GC-ONFH源BMSCs）、B组（GC-ONFH源BMSCs经AID重组慢病毒转染）、C组（GC-ONFH源BMSCs经慢病毒空载体转染）、D组（股骨颈骨折BMSCs）。取第3代细胞，以转染倍数（MOI=25 pfu）行病毒转染，12 h后换液。以嘌呤霉素选择培养基筛选，约2周后获得抗性克隆细胞并大量扩增。与此同时，C组行空载体转染，转染倍数同前，D组行常规诱导。

1.3 检测指标与方法

1.3.1 MTT检测

将细胞浓度调整为5×104/ml，接种至96孔板，每组各10孔，每孔加入完全培养基孵育过夜。在24、48、72 h的各个时间点分别每孔加入20 μl MTT溶液，在培养箱内放置4 h后弃上清，加进150 μl DMSO，酶联免疫检测仪记录各孔吸光值。

1.3.2 线粒体膜电位检测

线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）检测，在0.5 ml含有50万细胞的细胞悬液内，加入0.5 ml JC-1染色工作液，37℃孵育20 min。600 g 4℃离心10 min后弃上清。用JC-1染色缓冲液洗涤后，流式细胞仪测定相对荧光强度。……