褚晨亮，王馨晨，郑 静，路 宽，黄 函，覃 亮

(1.肇庆学院 食品与制药工程学院，广东 肇庆 526061；2.东北林业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040；3.肇庆学院 教学评估与督导中心，广东 肇庆 526061)

三桠苦Melicopeptelefolia(Champ.ex Benth) Hartley是芸香科蜜茱萸属植物，又称三丫苦、三叉苦、三枝枪等，始载于《岭南采药录》，具有清热解毒、祛风除湿的功效，临床上用于多种疾病的治疗[1]。以三桠苦药材为主药，开发了三九胃泰、三九感冒灵等中成药。三桠苦药材主要含有挥发油和生物碱[2]，生物碱类化合物具有抗肿瘤活性[3-6]，文献报道从三桠苦药材中分离得到多种生物碱[7]，但是目前对其抗肿瘤活性及其机制的研究较少，为进一步研究三桠苦生物碱类成分，阐述其抗肿瘤活性机制，本实验利用生物碱富集方法，从三桠苦茎的乙醇提取物中富集、初步分离得到8个生物碱，鉴定为吴茱萸春碱、茵芋碱、香草木宁碱、白鲜碱、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、4-methoxy-2(1H)-quinolinone、R-(+)-platydesmin、7-羟基白鲜碱，以人肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC为研究对象，采用CCK-8法分别进行体外抗肿瘤活性筛选，并利用分子对接技术阐述具有体外抗肿瘤活性的生物碱类成分抗肿瘤机制，这有利于阐明其有效成分，为医药企业对该药材进行深入开发提供依据。

1 仪器与材料

旋转蒸发仪RE-2000(上海亚荣仪器有限公司)，NMR(Bruker 400 ASCENDTM)。乙酸乙酯、乙醇(95%)、二氯甲烷、氯仿、甲醇(均为分析醇，购自天津富宇精细化工有限公司)，硅胶(青岛海洋化工厂)，ODS柱色谱填料(Merck，德国)，Sephadex LH-20 柱(Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞士)，肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC(广东省中医科学研究院)，DMEM培养基(Hyclone，美国)，胎牛血清(FBS，Hyclone，美国)，TransDetect Cell Counting Kit(CCK)，货号：FC101-04，北京全式金生物科技有限公司。喜树碱为阳性对照品(CDGO-100532，中国药品生物制品检定所)。

三桠苦于2019年6月采集于肇庆鼎湖山。原植物经广东药科大学刘基柱教授鉴定为芸香科蜜茱萸属植物三桠苦，保存在肇庆学院理工楼C608室(SYK-0618)。

2 实验方法

2.1 提取和分离

取干燥的三桠苦茎枝粗粉30 kg，用95%乙醇冷浸提取3次(120 L×3)，每次提取2 d，合并提取液，减压浓缩，挥干剩余溶剂，得到乙醇提取物(2.6 kg)。三桠苦乙醇提取物(2.6 kg)用5%HCl水溶液捏溶，过滤，滤液用浓氨水调节pH=10，氯仿萃取6次，合并萃取液，浓缩，得粗生物碱1(79.0)g；碱水层继续用NaOH调节pH=13，用氯仿萃取6次，合并萃取液，浓缩，得粗生物碱2(4.5 g)，根据薄层色谱结果将粗生物碱1和粗生物碱2合并，得粗生物碱(83.5 g)。

取粗生物碱(80.0 g)，3.5 g留样，经硅胶(100～200目)柱色谱分离，二氯甲烷：乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到18个流分(Fr.1～18)，Fr.2(2.5 g) 经硅胶(200～300目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到6个流分(Fr.2.1～2.6)，Fr.2.2(32.5 mg)经葡聚糖凝胶色谱纯化，得到化合物1(20.2 mg)；Fr.2.3(102.5 mg))经硅胶(300～400目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到化合2(22.5 mg)；Fr.2.5(152.3 mg)经硅胶(300～400目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到5个流份(Fr.2.5.1～2.5.5)，Fr.2.5.3(19.5 mg)经 Rp-18(MeOH∶H2O 70∶30)纯化，得到化合物3(14.6 mg)；Fr.2.5.5(39.5 mg))经sephadexLH-20(CHCl3∶MeOH 30∶70))纯化，得到化合物4(15.3 mg)；Fr.3(4.2 g) 经硅胶(200～300目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到10个流份(Fr.3.1～3.10)，Fr.3.7(202.3 mg))经硅胶(300～400目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到6个流份(Fr.3.7.1～3.7.3)，Fr.3.7.4(40.4 mg))经 Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)纯化，得到化合物5(28.6 mg)；Fr.3.7.6(15.8 mg) 经 Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)纯化，得到化合物6(9.6 mg)；Fr.4(3.5g)经硅胶(200～300目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到7个流份(Fr.4.1～4.7)，Fr.4.5(72.5 mg)经硅胶(300～400目)柱色谱分离，二氯甲烷∶乙酸乙酯(1∶0～0∶1)梯度洗脱，得到3个流份(Fr.4.5.1～4.5.3)，Fr.4.5.3(18.4 mg)经 Rp-4-18(MeOH∶H2O 60∶40)纯化，得到化合物7(10.5 mg)；Fr.4.7(23.8 mg) 经 Rp-18(MeOH∶H2O 60∶40)纯化，得到化合物8(11.5 mg)。

2.2 体外抗肿瘤活性筛选

利用CCK-8法体外测定8个生物碱对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC的抑制率。肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC分别用1640培养基(加10%胎牛血清、100μg·L-1青霉素和100μg·L-1链霉素)培养于5%CO2，37 ℃的培养箱。在96孔板中接种100μL的细胞悬液(每孔2×103个细胞)，根据实验需求在37度、5%二氧化碳培养箱中预培养24 h。加入不同浓度(5、12.5、25、50、100μm/L)的化合物(1～8)处理细胞，继续培养12 h，每孔中加入11μL的CCK 溶液，在二氧化碳培养箱中继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处的OD，重复6次，记录OD值并计算各待测化合物的抑制率，利用SPSS软件计算IC50，设计细胞对照和培养基本底对照。

2.3 抗肿瘤机制研究

文献研究表明，能够诱导肝癌细胞、胃癌细胞凋亡的途径包括死亡受体途径、线粒体途径、阻滞细胞周期途径等[8]，本实验通过查阅与这两个肿瘤细胞凋亡途径有关的蛋白靶点，明确肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC相关分子对接的靶点，即Caspase-3，VEGF-2，MMP-9，CDK四个靶点，以四个靶点分别对接8个化合物来进行抗肿瘤机制研究。

3 结果

3.1 结构鉴定

化合物1：白色针晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.52(1H，d，J=2.9Hz，H-2)，7.01(1H，d，J=3 Hz，H-3)，4.40(3H，s，4-OMe)，3.93(3H，s，7-OMe)，8.12(1H，d，J=9.1 Hz，H-5)、δ7.06(1H，dd，J=9.1，2.3 Hz，H-6)、δ7.31(1H，d，J=2.3 Hz，H-8)。13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：164.6(C-8b)，161.0(C-7)，156.8(C-4)，147.6(C-8a)，142.5(C-2)，123.6(C-5)，116.8(C-6)，113.5(C-4a)，106.0(C-8)，105.0(C-3)，101.9(C-3a)，58.8(4-OMe)，55.3(7-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[9]，故鉴定化合物1为吴茱萸春碱。

化合物2：淡黄色针晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.53(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.00(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，4.00(3H，s，7-OMe)，4.07(3H，s，8-OMe)，7.96(1H，d，J=9.2 Hz，H-5)，7.20(1H，d，J=9.2 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)，δ：164.0(C-8b)，157.2(C-4)，152.2(C-8)，143.1(C-2)，142.0(C-7)，141.6(C-8a)，118.2(C-5)，115.0(C-4a)，112.2(C-6)，104.5(C-3)，102.0(C-3a)，61.6(8-OMe)，59.0(4-OMe)，56.9(7-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[10]，故鉴定化合物2为茵芋碱。

化合物3：淡黄色针晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.51(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.01(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.39(3H，s，4-OMe)，3.99(3H，s，6-OMe)，3.99(3H，s，7-OMe)，7.40(1H，s，H-5)、7.29(1H，s，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：163.1(C-8b)，155.6(C-4)，152.7(C-7)，147.7(C-6)，142.6(C-8a)，142.5(C-2)，113.0(C-4a)，106.6(C-8)，104.7(C-3)，102.3(C-3a)，100.3(C-5)，58.6(4-OMe)，56.0(6-OMe)，56.0(7-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[10]，故鉴定化合物3为香草木宁碱。

化合物4：浅黄色粒状结晶(CHCl3)。1H-NMR(400MHz，CDCl3)δ：7.61(1H，d，J=2.7 Hz，H-2)，δ7.05(1H，d，J=2.7 Hz，H-3)，4.43(3H，s，4-OMe)，8.25(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.45(1H，t J=7.6 Hz，H-6)，7.66(1H，t J=7.6 Hz，H-7)，8.01(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3))δ：164.1(C-8b)，157.0(C-4)，145.9(C-8a)，143.8(C-2)，129.9(C-7)，128.0(C-8)，124.0(C-6)，122.5(C-5)，119.0(C-3a)，105.0(C-3)，103.5(C-4a)，59.3(4-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[11]，故鉴定化合物4为白鲜碱。

化合物5：白色针晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3) δ：7.68(1H，d，J=8.5 Hz，H-6)，7.40(1H，t，J=7.5 Hz，H-7)，7.62(1H，t，J=7.5 Hz，H-8)，7.98(1H，d，J=8.4 Hz，H-9)，4.05(s，3H，5-OMe)，3.90(1H，dd，J=6.5，5.0 Hz，H-3)，3.21(1H，dd，J=5.0，17.2 Hz，H-4β)，2.96(1H，dd，J=17.2，6.5 Hz，H-4α)，1.45(s，3H，2-Me)，1.47(s，3H，2-Me)13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：79.0(C-2)，68.5(C-3)，26.6(C-4)，108.5(C-4a)，160.8(C-5)，120.5(C-5a)，125.4(C-6)，123.8(C-7)，123.0(C-8)，121.0(C-9)，146.5(C-9a)，164.0(C-10a)，21.5(2-Me)，25.0(2-Me)，61.2(5-OMe)以上数据与文献报道数据一致[12]，故鉴定化合物5为4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline。

化合物6：浅黄色针晶(CHCl3)。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.87(1H，d，J=8.4 Hz，H-5)，7.22(1H，m，H-6)，7.47(1H，m，H-7)，7.67(1H，d，J=8.5 Hz，H-8)，3.52(1H，dd，J=16.5，7.1 Hz，10α-H)，3.69(1H，dd，J=7.1，16.5 Hz，10β-H))，4.61(1H，t，J=7.1Hz，H-11)，4.16(3H，s，4-OMe)，1.28(3H，s，13-Me)，1.49(3H，s，14-Me)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：147.5(C-1)，168.7(C-2)，102.1(C-3)，159.0(C-4)，122.0(C-5)，123.5(C-6)，123.0(C-7)，127.1(C-8)，120.3(C-9)，29.3(C-10)，86.7(C-11)，71.6(C-12)，58.5(4-OMe)，24.7(13-Me)，26.2(14-Me)。以上数据与文献报道数据一致[13]，故鉴定化合物6为R-(+)-Platydesmin。

化合物7：浅灰色针晶(MeOH)。1H-NMR(400MHz，DMSO-d6) δ：11.40(1H，s，N-H)，5.99(1H，s，H-3)，7.31(1H，d，J=8.5 Hz，H-5)，7.18(1H，t，J=7.7 Hz，H-6)，7.51(1H，t，J=7.7 Hz，H-7)，7.82(1H，d，J=8.5Hz，H-8)，3.95(3H，s，4-OMe)。13C-NMR(100 MHz， DMSO-d6) δ：164.0(C-2)，163.0(C-4)，138.9(C-8a)，131.2(C-7)，122.7(C-5)，122.0(C-6)，115.8(C-4a)，115.0(C-8)，96.8(C-3)，56.5(4-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[14]，故鉴定化合物7为4-methoxy-2(1H)-quinolinone。

化合物8：淡黄色粒晶(MeOH)。1H-NMR(400 MHz，DMSO-d6) δ：10.09(1H，s，7-OH)，7.89(1H，d，J=2.6 Hz，H-2)，δ7.36(1H，d，J=2.6 Hz，H-3)，4.37(3H，s，4-OMe)，8.02(1H，d，J=9.1Hz，H-5)，7.02(1H，dd，J=9.1，1.7 Hz，H-6)，7.09(1H，d，J=1.7Hz，H-8)；13C-NMR(100MHz，DMSO-d6) δ：143.0(C-2)，105.4(C-3)，101.5(C-3a)，158.5(C-4)，112.2(C-4a)，123.8(C-5)，116.6(C-6)，156.8(C-7)，109.0(C-8)，147.3(C-8a)，164.2(C-8b)，59.5(4-OMe)。以上数据与文献报道数据一致[15]，故鉴定化合物8为7-羟基白鲜碱。

3.2 抗肿瘤活性筛选

利用CCK-8法体外测试8个生物碱类成分对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC的抑制活性，以喜树碱作为阳性对照药品，结果(表1)表明：R-(+)-Platydesmin、4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline对肝癌细胞HepG-2具有较高的抑制活性，IC50值分别为26.4 μM、23.6 μM；对胃癌细胞BGC也具有较高的抑制活性，IC50值分别为21.8 μM、24.2 μM；白鲜碱、7-羟基白鲜碱对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC均表现出了抑制活性，IC50值分别为42.3 μM、40.9 μM、48.6 μM、47.5 μM，其他生物碱对这两种肿瘤细胞的抑制率不明显。

表1 化合物1～8对肝癌细胞HepG-2和胃癌细胞BGC的抑制活性

3.3 抗肿瘤机制研究

与细胞周期有着密切关系的调控基因能否正常有序表达，决定着细胞周期能否正常运转，其调控与细胞周期蛋白(Cyc-lin)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(CDKI)、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK))也关系紧密，三者通常以CDK 为核心，Cyclin 对其具有正调控作用，CDKI 对其具有负调控作用。通过分子对接技术研究发现R-(+)-platydesmin和4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline可能与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶(CDK)存在相互作用，见图1、图2，表明这两个生物碱可能是通过抑制细胞周期调控蛋白表达、阻滞细胞周期来抑制肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC细胞的增殖。通过体外活性研究实验，证实这两个生物碱对肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC均具有较高的抑制活性，说明这两个生物碱能够抑制这两种肿瘤细胞活性，诱导其凋亡，可能与阻滞细胞周期有关。其他6个生物碱分别与4个靶点对接，结果均未能找到相互作用的迹象，体外活性实验也验证了白鲜碱、7-羟基白鲜碱对两种肿瘤细胞抑制活性较差，其他4个生物碱未表变现出抑制活性。

图1 R-(+)-platydesmin与CDK可能的分子间相互作用

图2 4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2- dimethy pyrano(2，3-b) quinoline与CDK可能的分子间相互作用

4 结语

天然植物中的生物碱类成分具有抑制多种肿瘤细胞增殖的活性，研究表明，其通过诱导肿瘤细胞分化与凋亡、抑制细胞端粒酶活性、抑制肿瘤细胞周期和增殖等多种途径，达到抑制肿瘤细胞增殖[16]。本实验从三桠苦中初步分离得到8个生物碱类成分，并利用肝癌细胞HepG-2、胃癌细胞BGC为对象进行了体外抗肿瘤活性检测，发现4-dihydro-3-hydroxy-5-methoxy-2，2-dimethy pyrano(2，3-b) quinoline、R-(+)-platydesmin对这两个肿瘤细胞具有较高的抑制活性。通过分子对接技术发现这两个生物碱与肿瘤细胞中的CDK存在相互关系，证实了这两种生物碱具有体外抑制肿瘤细胞活性，初步阐释了其抗肿瘤活性机制。在这个实验中还有很多含有生物碱的流分还未被分离，课题组会进一步分离生物碱类成分，估计还会有其他生物碱被分离出来，同时会进行体外抗肿瘤活性分析，可能还会发现对肿瘤细胞有较高活性的生物碱。这有利于阐明其有效成分，为扩大三桠苦的临床应用基础、为医药企业对该药材进行深入开发提供必要依据。