丁 涛，韩昊洋，崔璐莹，董俊升，李建基，孟 霞，朱国强，王 亨

(扬州大学 兽医学院 教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009)

硒是动物体内一种必需微量元素，以硒蛋白的形式发挥抗氧化和抗炎的作用，还参与甲状腺激素代谢、氧化还原信号转导和免疫应答的调节[1-2]。动物饲料中主要使用的硒补充剂是无机物形式，特别是亚硒酸钠。近期研究发现，无机硒存在生物利用率低及毒性高的问题，用有机硒替代无机硒在动物饲料中的应用已引起了广泛关注[3]。当硒摄入不足时，会引起肌肉营养不良，心肌变性，牛奶和羊毛产量降低，生育力和产仔量减少等健康问题；而当硒摄入过量，会发生硒蓄积中毒，引起肝脏、心肌、脾脏和肾脏病变[4-6]。乳腺炎主要是由细菌感染引起的乳腺炎症反应，是人类和动物常见的疾病之一[7]。近年来，随着中国奶牛养殖的逐渐规模化、标准化，乳房炎的防控取得明显成效，但奶牛乳腺炎仍是损害奶牛福利和食品安全的重要疾病之一，同时也是影响奶牛养殖效益的主要疾病[8]。金黄色葡萄球菌(S.aureus)是乳腺炎中最常见的感染性病原体，但目前对于S.aureus性乳腺炎仍没有有效的治疗方法。研究发现，硒缺乏会导致奶牛围产期疾病，子宫内膜炎和乳腺炎发病率增加[2]。当奶牛处于缺硒状态，谷胱甘肽过氧化物酶活性急剧下降，并引起氧化应激，而补充硒可减轻氧化应激[2,6]。此外，在奶牛妊娠后期添加硒酵母，可以增加血浆硒的水平，增强抗氧化酶的活力，改善抗氧化功能，并有效减轻早期哺乳期发生的氧化应激，改善动物健康状况[5]。高羊毛氨酸硒(selenohomolanthionine,SeHLan)作为一种新型氨基酸有机硒，最早是在日本辣萝卜中被发现。在高羊毛氨酸硒对大鼠的毒性试验研究中，证明了相比硒代蛋氨酸(SeMet)，其不在胰腺蓄积，因此SeHLan有望成为不引起胰腺损伤的新型硒的补充来源[9-10]。但目前对其在病原微生物感染过程中的作用研究较少。本研究通过添加不同水平SeHLan，研究其对S.aureus诱导的乳腺炎大鼠的血液、乳腺和肝脏抗氧化能力以及对乳腺组织硒蛋白基因表达的影响，揭示补充SeHLan对乳腺炎大鼠的影响，并为SeHLan的生产应用提供理论基础和应用支持。

1 材料与方法

1.1 日粮组成及硒的来源试验采用基于氨基酸为配方的基础日粮，购自常州鼠一鼠二公司。日粮组成及营养成分见表1，不含任何形式的硒。SeHLan由上海英联贸易有限公司提供，通过添加补充硒。

表1 基础饲粮组成及营养成分 g

1.2 试验动物及处理24只健康怀孕的Wistar大鼠，8～10周龄，体质量200～250 g，由扬州大学实验动物中心提供，于配种后单笼饲养，提供基础日粮和饮水，室温为(24±1)℃，明暗周期为12 h。SeHLan以缺硒、正常硒和富硒的剂量添加，即0.03，0.15,1.50 mg/kg，从配种后即开始添加饲喂。在分娩后4 d，用异氟烷吸入麻醉大鼠，将100 μLS.aureus(2×107CFU/mL) 分别通过乳导管注入两侧第4对乳腺中，对照组注射等量的PBS。将其分为4组:对照组(添加硒为0.15 mg/kg)，乳腺中注射PBS；试验组为S.aureus感染Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，分别添加0.03，0.15,1.50 mg/kg 硒，并进行乳腺内注射S.aureus。

1.3 样品采集在乳腺内注射S.aureus后12 h，用异氟烷进行吸入麻醉。对腹部进行消毒，切开并分离腹部皮肤，分离并收集乳腺组织和肝脏，并采集血液，分离血清。

1.4 主要试剂和仪器S.aureus，由扬州大学兽医外科实验室分离自奶牛乳腺炎，并鉴定保存； SOD、MDA、GPX和T-AOC检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；TRIzol、反转录试剂盒和SYBR qPCR MIX购自南京诺唯赞生物公司；紫外可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；酶标仪购自美国Bio Tek公司；Nanodrop 2000分光光度计购自美国Thermo Scientific公司；CFX ConnectTM荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司。

1.5 荧光定量PCR检测大鼠乳腺组织中硒蛋白mRNA表达根据NCBI数据库中大鼠GPX1、GPX4、Sepp1和β-actin基因序列，并利用Primer Premier 6.0软件设计特异性引物。引物序列见表2，由南京擎科生物科技公司合成。TRIzol试剂提取乳腺组织的总RNA，使用Nanodrop 2000分光光度计测量RNA的浓度和纯度，并通过1.5%琼脂糖凝胶电泳验证RNA完整性。使用反转录试剂盒将1 000 ng RNA反转录为cDNA。反应体系总体积为20 μL，SYBR qPCR MIX 10 μL，cDNA模板1.5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 6.5 μL。使用CFX ConnectTM实时荧光定量PCR，设置反应条件为95℃预变性2 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，循环40次；95℃ 15 s，60℃ 5 s，95℃ 50 s。使用2-△△Ct相对定量的方法计算每个靶基因的相对表达量。β-actin 被用作内参基因。

表2 荧光定量PCR引物序列

1.6 氧化与抗氧化相关指标检测将乳腺组织测质量，用组织研磨机研磨成10%匀浆，4℃、2 000 r/min离心10 min，去除上层乳脂，再次离心去除沉淀，收集上清液。类似的方法对肝脏进行匀浆，收集上清液。然后，进行乳腺、肝脏和血清中氧化应激相关指标T-AOC、GPX、SOD和MDA的检测。

2 结果

2.1 不同硒水平对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎乳腺组织硒蛋白mRNA表达的影响如图1所示，与对照组相比，S.aureus感染后，组Ⅱ大鼠乳腺GPX1、GPX4和Sepp1的mRNA表达极显著降低(P<0.01)。与Ⅱ组相比，Ⅰ组乳腺中GPX1和Sepp1的mRNA显著下降(P<0.05)，Ⅲ组大鼠乳腺GPX1和Sepp1的mRNA水平极显著升高(P<0.01)。缺硒或者富硒对乳腺组织中GPX4 的mRNA表达的影响差异不显著。

1.GPX1 mRNA相对表达量；B.Sepp1 mRNA相对表达量；C.GPX4 mRNA相对表达量图1 乳腺组织中硒蛋白mRNA表达水平

2.2 不同硒水平对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎乳腺组织抗氧化相关指标的影响如图2所示，与对照组相比，S.aureus感染后，Ⅱ组乳腺中T-AOC、GPX和SOD的活力显著升高(P<0.05)，MDA水平下降但无统计学差异。与Ⅱ组相比，Ⅰ组大鼠乳腺组织中的T-AOC、GPX和SOD的活力显著降低(P<0.05)，MDA水平显著升高(P<0.05)。Ⅲ组大鼠乳腺中 GPX和T-AOC的活力显著升高(P<0.05)，MDA显著下降(P<0.05)，而SOD活力无显著变化。

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量图2 乳腺抗氧化相关指标

2.3 不同硒水平对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎血清抗氧化相关指标的影响与对照组相比，S.aureus感染后，Ⅱ组大鼠血清中T-AOC、GPX、SOD和MDA变化差异不显著。与Ⅱ组相比，Ⅰ组大鼠血清中GPX和SOD活力极显著下降(P<0.01)，T-AOC下降但无差异显著性，MDA显著升高(P<0.01)。与Ⅱ组相比，Ⅲ组大鼠血清中GPX 和T-AOC的活力极显著或显著升高(P<0.01或P<0.05)，MDA浓度显著下降(P<0.05)，SOD活力差异不显著。

2.4 不同硒水平对S.aureus诱导的大鼠乳腺炎肝脏组织抗氧化相关指标的影响与对照组相比，S.aureus感染后，Ⅱ组大鼠肝脏中T-AOC、GPX、SOD和MDA变化差异不显著。与Ⅱ组相比，Ⅰ组大鼠肝脏中GPX和T-AOC的活力极显著或显著下降(P<0.01或P<0.05)，MDA极显著升高(P<0.01)。与Ⅱ组相比，Ⅲ组大鼠肝脏中GPX活力极显著升高(P<0.01)，MDA显著下降(P<0.05)，T-AOC活力升高但无差异显著性，SOD活力在各组间差异不显著。

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量图3 血清抗氧化相关指标

A.T-AOC活力；B.GPX活力；C.SOD活力；D.MDA含量图4 肝脏抗氧化相关指标

3 讨论

啮齿动物有24种硒蛋白，许多研究表明硒蛋白转录物可以用作评估硒状态的分子生物标记物。GPX1广泛存在于各种组织中，在抗氧化防御过程中发挥重要的作用，大鼠硒缺乏GPX1的mRNA水平急剧下降，随着饮食中硒含量增加，其mRNA表达成S型增加，并在一定的硒水平时达到平台期[11]。郝宏晓等[12]的研究在奶牛日粮中添加硒也提高了肝脏中GPX1 的mRNA表达。也有研究表明，肝脏中GPX4和Sepp1 的mRNA水平不受大鼠硒状态的影响[13]。本研究给妊娠期大鼠饲喂不同水平的硒，结果显示，补硒能显著促进大鼠乳腺中GPX1和Sepp1的mRNA表达，而缺硒或补硒对GPX4的 mRNA表达无显著影响。可能GPX4主要存在于睾丸，具有组织特异性，ZHOU等[14]发现当大鼠处于硒缺乏状态，睾丸中GPX4的mRNA降低。

SUN等[15]研究发现对猪腹腔注射LPS后，25个硒蛋白中有14个硒蛋白的基因表达受到影响。与注射盐水的猪相比，注射LPS的猪的肝脏中Sepp1、GPX2和Txnrd2 mRNA表达显著降低，说明在LPS诱导的炎症过程影响了硒蛋白的代谢。在本研究中，在饲喂正常硒水平的条件下，S.aureus感染后乳腺组织中GPX1、GPX4和Sepp1的mRNA表达极显著降低，说明乳腺感染S.aureus也影响了硒蛋白的代谢。

动物体内有几种已知的内源性抗氧化防御机制，第一类是GPX、SOD、CAT等酶抗氧化剂，可减少过氧化氢、脂质和磷脂氢过氧化物，抵抗活性氧积累产生的有害影响，是细胞内抗氧化防御的主要形式[16]。SOD催化超氧自由基生成过氧化氢(H2O2)，H2O2再被GPX和CAT代谢为水。第二类是非酶类的抗氧化剂，通常称为清除抗氧化剂，主要包括抗坏血酸、尿酸、谷胱甘肽、维生素E和泛醇等。它们通过中和或清除自由基活性。T-AOC是由非酶的和酶的抗氧化系统组成，T-AOC水平反映了清除自由基的能力，对维持细胞内环境的氧化还原平衡很重要。MDA是脂质过氧化物代谢产物，其含量反映了机体内脂质过氧化程度，间接反应细胞的损伤程度。在本研究中，S.aureus感染后乳腺组织中GPX、SOD和T-AOC升高，这可能是机体应对氧化应激产生的一种适应性反应，通过提高抗氧化酶活力来缓解机体的损伤程度。乔娜等[17]的研究发现小鼠精原细胞在缺氧处理后，细胞中产生了大量的MDA和ROS，同时抗氧化酶T-AOC和CAT的活力也显著升高。研究发现杀虫脲引起BALB/c小鼠肝脏和肾脏的氧化应激，并且肝脏和肾脏中的抗氧化酶活性显著增加[18]。这与我们的结果相似，机体或细胞通过提高抗氧化酶活力来对抗不良刺激。MIAO等[19]在链球菌大鼠乳腺炎中的研究结果与我们不一致，他们发现在感染后16,24 h，乳腺组织和血清中T-AOC和SOD的活力显著降低，而MDA含量显著增加。在本研究中，S.aureus感染后乳腺组织中抗氧化酶活性升高，而对肝脏和血清的氧化应激相关指标均无影响，可能本研究选用的菌株感染引起的损伤较轻微，或感染的时间不够长，引起的氧化损伤较轻，没有对肝脏和血清的抗氧化酶活力造成显著影响。GONG等[5]研究发现于奶牛妊娠后期添加硒酵母，可以增加血浆硒的状况，增强抗氧化酶的活力，改善抗氧化功能，并有效减轻早期哺乳期发生的氧化应激。本研究中，饲喂缺硒饮食，乳腺、血清和肝脏中MDA含量升高，抗氧化酶活性降低，这表明硒缺乏可引起各种组织氧化损伤。富硒饮食增强了乳腺、血清和肝脏的GPX和T-AOC的活力，降低了MDA的含量。

综上，妊娠期补充高剂量的SeHLan可提高抗氧化酶活性，增强了机体的抗氧化能力，减轻了S.aureus乳腺炎引起的氧化应激。