叶 睿，周 浩，陈 婷，孙加节，习欠云，张永亮

(华南农业大学 动物科学学院 国家生猪种业工程技术研究中心 广东省动物营养调控重点实验室，广东 广州 510642)

在人和动物的一生中，骨一直经历着动态的重塑过程，破骨细胞移除旧骨或受损骨，成骨细胞形成新骨。在衰老过程中骨吸收与骨形成的平衡被破坏致使骨密度降低和骨微结构破坏[1]。老年狗和大鼠在衰老过程中骨量减少，骨骼强度降低[2-3]。骨质疏松性骨折引起的疼痛、畸形和死亡严重影响老年人的健康。随着老龄化社会的迅速上升，这些病例的数量将显著增加[4]。同样，如今随着人们生活水平提高，宠物的数量越来越多，因此老年宠物的数量也越来越多，同样，它们也会面临骨质疏松这类老年疾病问题。骨质疏松症的治疗过去是长期的过程，如使用双磷酸盐和雌激素[5]。然而，在药物治疗过程中会有一些不良反应，如胃肠道反应、肾毒性、骨髓性骨性，甚至增加肿瘤风险[6]，因此还需要研究新的骨质疏松治疗方法。

神经内分泌生长轴(GHRH-GH-IGF-Ⅰ轴) 是重要的内分泌轴,该内分泌轴中的生长激素(growth hormone,GH)和IGF-Ⅰ(insulin-like growth factor Ⅰ)在骨骼生理中均起重要作用[7-9]。但是随着年龄的增长，GH和IGF-Ⅰ的水平显著降低[10]。同样随着年龄的增长，家犬等宠物体内的IGF-Ⅰ水平逐渐下降[11]。在中/大型犬中，年轻犬GH和IGF-Ⅰ浓度显著高于老龄犬[12]。持续注射重组GHRH蛋白可以恢复正常的GH模式，并且不会使GHRH受体脱敏和抑制GH的分泌[13]。但是，由于重组GHRH蛋白在体内半衰期短，需要经常注射(1～3次/d)[14]。有研究表明，质粒治疗是可扩展的，是一种有前景的方法，在大型动物模型和人类中可诱导蛋白的产生和调节蛋白的分泌[15-16]。给动物肌肉注射肌肉特异性启动子控制表达的GHRH质粒，可使动物体内长时间维持高GH和IGF-Ⅰ水平[17-19]。与对照组相比，肌注pSK-GHRH可使小鼠血清GH至少升高2周，肝脏IGF-Ⅰ mRNA水平升高[20]。同样，给比格犬注射GHRH表达质粒提高了其血清IGF-Ⅰ水平，且没有发现副作用[21]。给老年宠物使用GHRH表达质粒是可行的方法。

D-半乳糖是建立衰老模型的经典物质。通过注射D-半乳糖，发现该大鼠骨质流失，骨小梁数量减少，表现出与老年男性骨质疏松相似变化[22]。所以本试验以D-半乳糖复制老年性骨质疏松模型。本试验通过给D-半乳糖衰老模型肌肉注射GHRH表达质粒，并结合电穿孔法处理，探究GHRH表达质粒对骨质疏松的防治作用。

1 材料与方法

1.1 试验材料40只12月龄SPF级KM雌鼠购于长沙市天勤生物技术有限公司(许可证号:SYXK(湘)2019-0014)；pVAX-GHRH表达质粒由本课题组(华南农业大学动物科学学院生理生化实验室) 构建，保存于-80℃冰箱内；D-半乳糖购自广州华奇盛生物科技有限公司;B型活体基因导入仪购自上海塔瑞莎健康科技有限公司;促生长激素释放激素(GHRH)、胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和血清骨特异性碱性磷酸酶(BLAP)检测试剂盒购于上海酶联生物科技有限公司。

1.2 GHRH表达质粒的制备与鉴定将质粒转化至大肠杆菌DH5α中,在液体LB中培养细菌,SDS碱变性法提取质粒后并纯化。使用0.9%的NaCl溶液溶解质粒,提取的质粒进行NheⅠ与XbaⅠ双酶切鉴定和测序比对，质粒由生工生物工程股份有限公司(上海)进行测序。

1.3D-半乳糖造骨质疏松模型及质粒注射将40只KM雌鼠分为4组，每组10只。第1组为对照组，每天颈背部皮下注射生理盐水，腿肌按80 μg/kg 注射pVAX空质粒；第2组为质粒组，每天颈背部皮下注射生理盐水，腿肌按80 μg/kg注射 pVAX-GHRH质粒；第3组为造模加质粒组，颈背部皮下按每天500 mg/kg注射D-半乳糖，连续7周，腿肌按80 μg/kg注射 pVAX-GHRH质粒；第4组为造模组，颈背部皮下按每天500 mg/kg注射D-半乳糖，连续7周。所有小鼠适应性喂养1周，在第3周腿肌注射质粒并活体基因导入仪电击(36 V、5 Hz)处理。

1.4 取样及处理在质粒注射处理后0，1，3周采用下颌静脉丛采血，第5周采用眼球取血。眼球取血后处死，分离血清，保存于-80℃环境。分离两侧股骨，清除肌肉组织与结缔组织固定于多聚甲醛中，右侧股骨用于做Micro-CT扫描。左侧股骨保存于-80℃环境，用于相关基因表达测定。

1.5 血清GHRH和IGF-Ⅰ检测将注射质粒后0，1，3，5周的血清常温静置解冻，利用酶联免疫吸附法检测血清GHRH和IGF-Ⅰ的水平。

1.6 骨代谢指标检测取注射质粒后5周血清，利用酶联免疫吸附法检测血清TRAP和BLAP的水平。

1.7 Micro-CT对小鼠股骨的分析将小鼠股骨附着组织剔除干净,放入Micro-CT仪,对股骨干骺端进行X射线扫描。扫描完成后,选取感兴趣区域(region of interest,ROI) 行三维重建,使用软件进行重建定量分析。获得以下参数：骨密度(bone mineral density,BMD)、骨体积分数(bone volume/tissue volume,BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness,Tb.Th)、骨小梁数量(trabecular number,Tb.N)、骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)、连接密度(connectivity density,Conn.D.)、结构模型指数(structure model index,SMI)。

1.8 股骨HE染色4%多聚甲醛固定股骨，进行脱钙处理，待脱钙完成达到切片标准后进行脱水、透明、浸蜡、包埋等步骤后制作成石蜡切片，并进行HE染色，光学显微镜下观察股骨组织形态，并拍照。

1.9 实时荧光定量PCRRT-PCR检测骨组织相关基因的表达量。取20 mg骨组织，使用Trizol法提取总RNA，经消化和反转获得cDNA，加入相应PCR反应体系进行扩增，采用2-ΔΔCt法计算各基因相对表达量，引物序列见表1。

表1 实时荧光定量PCR引物信息

2 结果

2.1 pVAX-GHRH质粒测序结果与目的序列比对pVAX-GHRH质粒用NheⅠ与XbaⅠ限制性内切酶进行酶切后，结果如图1所示，pVAX-GHRH质粒双酶切分别在500,2 500 bp处出现条带，与理论酶切片段大小一致，而且质粒的测序结果与设计的基因序列相同，由此证明质粒的正确性。

1，2.pVAX-GHRH质粒双酶切；M1.DL2000 DNA Marker；M2.DL5000 DNA Marker图1 pVAX-GHRH质粒酶切鉴定

2.2 血清中GHRH和IGF-Ⅰ的含量变化注射GHRH质粒组血清GHRH浓度在第1，3周时较对照组显著升高,血清IGF-Ⅰ浓度在第3周显著高于未注射GHRH组。结果表明,注射GHRH表达质粒能在较长时间内增加小鼠血清GHRH和IGF-Ⅰ水平(图2)。

图2 各组血清中GHRH浓度(左)和IGF-Ⅰ浓度(右)变化

2.3 股骨Micro-CT扫描指标见表2。与空质粒组相比注射GHRH质粒组小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Conn.Dn都有所增加，并且Tb.Sp降低，说明GHRH可以增加12月龄小鼠皮质骨和小梁骨的骨量，但没有达到统计学差异显著水平，其原因可能是样本数较少。与空质粒组相比注射D-半乳糖可以显著降低了12月龄小鼠的股骨骨量，破坏骨结构，说明注射D-半乳糖成功导致了小鼠的骨质疏松。通过给造模组注射GHRH质粒增加了股骨BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th和Conn.Dn，并且降低了Tb.Sp和SMI，但没有达到统计学差异显著水平。

表2 各组小鼠股骨Micro-CT骨微结构参数分析(n=3)

2.4 股骨Micro-CT二维图(2D)和三维图(3D)观察结果3D图反映骨小梁的厚度分布情况,颜色从绿到红,反映骨小梁从薄到厚，2D图可见骨髓腔内骨小梁数量。与空质粒组相比，注射GHRH质粒组小鼠股骨小梁骨骨量更多，排列更加致密，空隙减少。D-半乳糖造模组骨小梁较细，数量较少，有断裂，并且有很大空隙。造模注射GHRH质粒组相比于造模组的骨小梁厚度增加，数量也较多，中间空隙有所减少(图3)。

图3 各组股骨Micro-CT三维图和二维图

2.5 股骨组织病理学形态分析由图4可见，HE染色结果显示，注射GHRH质粒组比空质粒组股骨结构更完整，小梁骨数量和面积更多，造模组骨小梁数量显著减少，造模后注射GHRH质粒组的骨小梁数量较造模组又有所增加，结构也比较完整。经过Image-Pro Plus 6.0 软件对骨小梁面积进行分析可见，注射GHRH质粒组的小梁骨面积占比有所增加，D-半乳糖造模组小鼠，骨小梁面积占比明显降低(P<0.05)，而给造模组注射GHRH质粒组的骨小梁面积占比增加(P<0.05)；说明注射GHRH质粒后，小鼠骨质丢失减少。

图4 小鼠股骨组织HE染色(左)及小梁骨面积占比(右)(20×)

2.6 骨代谢相关生化指标相对于空质粒组，GHRH质粒组血清中TRAP和BLAP没有明显变化，D-半乳糖造模组血清中TRAP含量显著升高(P<0.05)、BLAP含量显著降低(P<0.05)，表明注射D-半乳糖促进了破骨活动，并且抑制了成骨。注射GHRH质粒提高了造模组小鼠BLAP的含量(P<0.05)，说明GHRH表达质粒能促进造模组的骨形成，但对TRAP没有影响(图5)。

注：图中不同小写字母表示差异显著P<0.05，相同字母表示差异不显著P>0.05。下同图5 各组血清中骨代谢相关生化指标

2.7 股骨的骨形成与骨吸收相关基因表达变化相对于空质粒组，注射GHRH质粒组的股骨中成骨和破骨相关基因表达量没有显著性差异。使用D-半乳糖造模能显著降低成骨相关因子OPG和OCN的表达且骨吸收相关因子TRAP和RANKL的表达显著增加(P<0.05)。相对于造模组，造模且注射GHRH质粒组的OPG和OCN表达有所增加，TRAP和RUNX2表达有所降低，但未达到差异显著水平。

图6 各组股骨中骨形成(OPG、OCN)和骨吸收(TRAP、RUNX2)相关基因mRNA相对表达量

3 讨论

宠物能够丰富人类的生活，兽医学专家和生物学家通过研究发现，接触宠物能改变心情，减轻病症和疼痛，改善人们身心的机能。伴侣动物能够帮助儿童培养自信和自尊心，培养儿童的领导欲和责任心；它们为老年人带来亲情、友情，给了老年人以精神寄托；工作犬可帮助残疾人料理日常生活[23]。《2019中国宠物行业白皮书》数据显示，全国城镇宠物犬、猫数量达9 915万只，比上一年增长8.6%。以此趋势，宠物的基数会越来越大。老年犬、猫的数量也会越来越多，随着它们不断衰老，与之而来的还有各种老年疾病。随着年龄的增长，骨骼重塑持续减缓，由此导致的骨骼代谢失衡开始导致骨骼骨重逐渐流失[24]。骨小梁和皮质骨均受影响，由于骨量的减少使骨骼强度显著降低，从而导致骨质疏松[25]。骨质疏松症是一种以骨量减少和骨折风险增加为特征的骨骼相关疾病[26]。因此老年性骨质疏松严重影响着老年动物的健康。

D-半乳糖是建立衰老模型的经典物质，其致衰老机制是指在一定时间内连续给动物注入一定量D-半乳糖，可导致其机体细胞内D-半乳糖浓度增高，过量的D-半乳糖在半乳糖还原酶的作用下可以转化为半乳糖醇，由于半乳糖醇不能进一步代谢，在细胞内积累，从而影响正常的渗透压，进而可导致氧化应激的表达增加，抗氧化剂表达减少，抗氧化防御系统恶化，从而形成更多的自由基导致机体衰老[27]。注射D-半乳糖促进了小鼠的骨吸收并且抑制了骨形成。通过对股骨进行Micro-CT扫描和切片分析可见，注射D-半乳糖严重破坏了骨微结构，减少了小鼠骨量。

GH和IGF-Ⅰ在骨吸收和骨形成的平衡中发挥重要作用。GH的许多功能是通过IGF-Ⅰ的产生实现的，IGF-Ⅰ被广泛认为是骨骼生长、发育和代谢的关键调控因子[24]。并且GH受体(GHr)和IGF-Ⅰ受体(IGF-Ir)存在于骨组织中[28]。通过组织形态计量学测量发现，IGF-Ⅰ的作用促进骨基质结合率的增加[29]。对骨形成和骨吸收的生化标志物检测证明了rhGH和IGF-Ⅰ均可诱导老年人骨转换的增加[30]。IGF-Ⅰ通过影响纵向和横向骨累积以及在成年后期和老年期间维持骨量，在生长中的骨骼发育中发挥重要作用[31]。GHRH可刺激垂体GH的合成和分泌[32]。动物衰老过程中，GHRH-GH-IGF-Ⅰ轴的激素分泌会发生变化。老年大鼠垂体GH mRNA、GH含量及生长激素释放激素受体(GHRHr)显著降低[33]。大鼠与年龄相关的GH分泌减少似乎是由GHRH分泌减少引起的[34]。动物垂体GH 的分泌释放受下丘脑释放的GHRH和生长抑素(somatostatin，SS)的调控，GHRH 促进垂体释放GH而SS抑制GH的释放[35]。而GH由垂体体细胞以脉动的方式分泌，通过刺激IGF-Ⅰ合成和分泌，直接或间接作用于周围组织[10,36]。pcDNA3-GRF(1-32)质粒通过肌肉注射给家兔，注射后31 d注射部位肌肉中GRF重组质粒仍能够进行转录并表达[37]。电转化法可以提高基因在动物体内的表达效率[38]。它可以用低剂量的单一质粒治疗多种疾病并产生长期疗效[39]。本试验中，给小鼠注射pVAX-GHRH表达质粒在较长时间内显著增加了小鼠血清中GHRH和IGF-Ⅰ的含量。通过Micro-CT扫描结果与股骨组织病理学形态分析给D-半乳糖诱导小鼠老年骨质疏松肌肉注射pVAX-GHRH质粒，能够回复部分D-半乳糖导致的骨量减少。但是，在对血清骨代谢标志物都无明显影响,可能是因为，在注射GHRH质粒35 d时血清中GHRH和IGF-Ⅰ水平已经回到与对照组相同的水平，所以对骨代谢标志物的影响无显著性差异，对骨量的促进作用不是特别明显可能是因为作用时间不够长，由于用于进行Micro-CT扫描的样本量较少(n=3)所以可能使统计结果没有差异。

骨质疏松症的治疗方法都在通过抑制骨吸收以及促进形成来预防骨折[40]。用于治疗老年骨质疏松症的药物主要有双磷酸盐、激素治疗和骨质疏松症营养补充剂[41]。双磷酸盐可预防病理性骨折，促进骨愈合，同时抑制骨吸收，减少骨质流失，增强骨质重塑过程，可以显著促进骨质疏松人和犬的骨矿物质密度[42-44]，但是在使用过程中会导致颌骨坏死、食管癌和肾功能衰竭等严重不良反应[45-46]。在雌性动物中雌激素缺乏与骨质疏松症发病率和严重程度增加密切相关[47]，雌激素替代疗法预防骨丢失和骨折已经在组织形态学和流行病学上得到证实[48]，雌激素疗法会增加深静脉血栓、胆囊疾病等风险[49]，使用雌激素治疗成本也较高，当治疗停止时，雌激素的骨骼益处会迅速消失[45]。钙和维生素D摄入不足也会导致骨质疏松。维生素D的经典功能是刺激肠道钙和磷酸盐的吸收，和肾对钙和磷酸盐的再吸收和调节骨矿物质代谢[50]，并且犬、猫无法通过阳光照射进行维生素D皮肤合成[51]。但是，维生素D与钙结合使用只在骨质疏松初级预防中起作用[52]，使用钙补充剂可能对心血管产生不良影响[53]。目前，在对不同基因疫苗研究表明，其对受体动物是相对安全的。利用电转化优化质粒DNA基因或DNA疫苗传递不会对组织产生损伤[54]，并且不需要频繁的服用或注射。这种治疗疾病的新策略是在生理水平上连续长期产生蛋白质，最大限度地减少副作用，并可能产生长期有益的效果[15]。在我们的试验过程中，在小鼠体内也没有发现明显的副作用。

综上所述，注射GHRH表达质粒可以增加血清中GHRH和IGF-Ⅰ含量，增加骨质疏松小鼠股骨骨量，因此注射GHRH表达质粒能够在一定程度上改善老年骨质疏松，有希望发展成为一种用于改善动物老年骨质疏松症的药物。