武 强,薛才华，王梦杰，刘嘉华，张龙飞，屠园园，吴 华

(青海大学 农牧学院，青海 西宁 810016)

细胞自噬(autophagy)是真核生物进行自我保护的一种机制，主要是通过溶酶体对细胞内的蛋白质和细胞器进行融合降解从而达到细胞稳态[1]。目前，为了解自噬的免疫机制都会深入研究自噬的调节通路。其中,mTOR信号通路是最常见的通路之一,mTOR介导的信号通路是调控细胞能量和营养代谢的重要枢纽。当细胞在营养缺乏、新陈代谢紊乱、炎症反应及外界压力的刺激下,细胞会产生相应的应激反应,mTOR的活性会降低，同时激活细胞的自噬；当细胞营养充足时,mTOR活性又会被激活，从而抑制细胞自噬[2]。

从植物提取出来的花青素颜色呈紫红色，属于花色苷类色素，属于黄酮类物质，天然可食用。人们常将黑果枸杞称为“花青素之王”[3]。黑果枸杞中的花青素功能较多，在细胞免疫功能上，目前的研究主要有增强淋巴细胞增殖、促进肿瘤细胞的凋亡[4]。巨噬细胞是体内的“打扫机器”，在免疫系统功能中起重要的作用。它不仅能够清除体内坏死的细胞和病原体，还能与溶酶体融合形成自噬溶酶体，以有效杀伤清除细菌[5]。因此，本试验拟通过AMPK-mTOR信号通路探讨黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞Raw264.7自噬的影响，从细胞自噬层面揭示黑果枸杞花青素的免疫机理。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂小鼠巨噬细胞株RAW264.7，购买于中国科学院上海细胞库；黑果枸杞花青素购自青海金麦杞生物科技有限公司(纯度61%、灰分0.6%、蛋白质6%、糖1.32%、氨基酸3.56%)；DMEM干粉、胎牛血清均购自Gibco公司；PBS购自Hfart公司；胰蛋白酶EDTA溶液0.25%购自Solarbio公司；雷帕霉素(RAPA)购自MedChemExpress公司；TRizol Universal总RNA提取试剂盒、 cDNA反转录试剂盒和Super Real彩色荧光定量预混试剂盒购自天根生化科技有限公司；山羊抗IgG购自Abcam公司；P-AMPK抗体购自BOSTER公司；P-mTOR抗体购自SAB公司；Ant-GAPDH购自Immunoway公司；MDC试剂盒和BCA蛋白定量试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.2 主要仪器超净工作台，购自江苏通净净化设备有限公司；CO2细胞培养箱，购自美国NUAIRE公司；高速低温离心机，购自英国Dynamica公司；PCR仪及荧光定量系统购自BIO-RAD；Western blot 转膜仪、Western blot 电泳仪、Western blot 电源均购自北京六一生物科技公司；摇床购自美国SCILOGEX公司；化学发光成像仪购自北京赛智科技有限公司。

1.3 试剂配制黑果枸杞花青素溶液的配制：将黑果枸杞花青素溶解于的DMEM培养基中，配置质量浓度为100 mg/L 的黑果枸杞花青素溶液为母液稀释使用，4℃冰箱避光保存；雷帕霉素抑制剂：精确称取0.091 4 g雷帕霉素加入1 mL的DMSO溶液，配制成浓度为100 mmol/L的母液稀释使用，置于-20℃ 冰箱保存，试验中雷帕霉素的最终浓度为100 nmol/L。

1.4 细胞培养将小鼠巨噬细胞RAW264.7 置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，用含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM培养液进行培养，每24 h换液1次，待细胞生长约70%～80%融合时将其传代，2～3 d进行1次细胞传代，传代培养足够的细胞以备用。

1.5 MDC染色法检测自噬体将细胞以每孔1×105细胞数接种至24孔板，设花青素质量浓度为0,12.5,25.0,50.0,100.0 mg/L，每组3个孔重复，37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养24 h后，使用细胞自噬染色检测试剂盒行MDC染色。具体操作步骤如下：300 μL 1×wash Buffer洗 1 次，加入10 μL 的MDC染液，轻轻混匀；室温避光染色 30 min，300 μL 1×wash Buffer 洗3次，加入100 μL 的 collection Buffer，使用荧光显微镜观察并拍照。

1.6 实时荧光定量PCR检测自噬相关因子mRNA的表达以细胞浓度为1×105接种至6孔细胞培养板后常规培养，待细胞达到70%～80% 融合时分组处理，每组3个重复。黑果枸杞花青素处理24 h后提取细胞总RNA，提取方法按照天根生化科技有限公司生产的TRizol Universal说明书进行操作，提取的RNA在微量核酸蛋白测定仪测定浓度及纯度。采用天根生化科技有限公司的cDNA 反转录试剂盒进行RNA逆转录反应和Super Real彩色荧光定量试剂盒进行荧光定量PCR反应，引物由上海生工生物公司合成。使用 Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System 对各组样本进行扩增，记录各样品扩增Ct值，采用2-△△Ct法计算各目的基因的相对表达量。

1.7 Western blot 检测自噬相关因子蛋白的表达分别收集各组细胞，加入蛋白裂解液提取总蛋白，利用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白含量。用30 μL 5×上样缓冲液与120 μL蛋白样本混合于200 μL的离心管中，于PCR仪上变性后泳道上样，经 SDS-PAGE 电泳后，半干转膜至PVDF膜，按比例配制 LC3-Ⅱ抗体、Beclin-1抗体、Ⅲ-PI3K抗体及 GADPH 抗体，4℃封闭过夜。TBST洗膜，室温5×6 min 摇洗，加入山羊抗IgG二抗，室温1 h后TBST洗膜，室温5×6 min摇洗。将保鲜膜置于暗盒中，可以在其底部加水以固定薄膜，将PVDF膜正面(蛋白附着面)朝上，放置于薄膜里。将发光液试剂盒中2种液体按1∶1比例混合，摇匀。滴加到PVDF膜上，反应5 min。用镊子夹起PVDF膜一角，使发光液自然流下，曝光显影观察。

1.8 数据分析采用Image J对条带量化，所有试验数据经Excel软件初步处理后，采用SPSS Statistics 21.0统计软件进行单因素方差分析，邓肯氏法进行多重比较， Graphpad Prism 8.0软件进行绘图。

表1 自噬因子mTOR和AMPK引物序列

2 结果

2.1 不同质量浓度黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体的影响细胞经MDC染色后，结果显示，对照组内含有少量荧光，花青素12.5 mg/L 组的荧光明显减少,花青素25.0,50.0,100.0 mg/L组看不到荧光(图1)。

图1 不同质量浓度花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬体的影响

2.2 黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬相关因子mRNA表达的影响结果显示,与对照组相比，花青素组极显著降低AMPK因子的mRNA表达(P<0.01)，极显著升高mTOR因子的mRNA表达(P<0.01)(图2)。

图2 黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬相关因子 mRNA表达的影响

2.3 黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬相关因子蛋白表达的影响结果显示,与对照组相比，花青素组极显著降低p-AMPK的蛋白表达(P<0.01)，极显著升高p-mTOR因子的蛋白表达(P<0.01)(图3)。

图3 黑果枸杞花青素对小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬相关因子蛋白表达的影响

2.4 黑果枸杞花青素结合雷帕霉素对自噬相关因子mRNA表达的影响结果显示,与对照组相比，雷帕霉素组极显著增加了AMPK因子的mRNA表达(P<0.01)，花青素+雷帕霉素组极显著降低了AMPK因子的mRNA表达(P<0.01)；雷帕霉素组极显著降低了mTOR因子的mRNA表达(P<0.01)，花青素+雷帕霉素组极显著降低了mTOR因子的mRNA表达(P<0.01)。与雷帕霉素组相比，花青素+雷帕霉素组极显著降低了AMPK因子的mRNA表达(P<0.01)；花青素+雷帕霉素组mTOR因子的mRNA表达差异不显著(P>0.05)(图4)。

注：与对照组相比,*表示差异显著(P<0.05)；**表示差异极显著(P<0.01)。与雷帕霉素相比，##表示差异极显著(P<0.01)。下同图4 黑果枸杞花青素结合雷帕霉素对自噬因子AMPK和mTOR mRNA表达的影响

2.5 黑果枸杞花青素结合雷帕霉素对自噬相关因子蛋白表达的影响结果显示，与对照组相比，雷帕霉素组极显著增加了p-AMPK因子的蛋白表达(P<0.01)，花青素+雷帕霉素组显著降低了p-AMPK因子的蛋白表达(P<0.05)；雷帕霉素组极显著降低了p-mTOR因子的蛋白表达(P<0.01)，花青素+雷帕霉素组显著降低了p-mTOR因子的蛋白表达(P<0.05)。与雷帕霉素组相比，花青素+雷帕霉素组极显著降低了p-AMPK因子的蛋白表达(P<0.01)；花青素+雷帕霉素组p-mTOR因子的蛋白表达差异不显著(P>0.05)(图5)。

图5 黑果枸杞花青素结合雷帕霉素对自噬因子p-AMPK和p-mTOR 蛋白表达的影响

3 讨论

巨噬细胞在机体的特异性和非特异性免疫过程中都起着很重要的作用，它不仅能直接吞噬病原微生物，还能作为抗原递呈细胞参与抗原的摄取、加工和处理过程，激发细胞和体液免疫反应[6]。自噬是巨噬细胞吞噬和清除体内病原微生物的重要调控机制，有研究表明，巨噬细胞的自噬功能下降可以降低其对体内凋亡细胞吞噬的效率[7]。

细胞自噬是一个动态的过程，主要可分为4个阶段，即自噬的诱导、自噬体形成、自噬溶酶体形成和自噬体降解。细胞在被诱导发生自噬后，首先在胞浆内会形成一种杯状的囊泡样结构，称为隔离膜(isolation membrane)或吞噬泡(phagopore)，并集结需降解的胞浆成分；然后隔离膜进一步延伸将胞浆成分包裹形成一个封闭的双层膜的结构，这一结构称为自噬体(autophosome)；自噬体随后在胞浆内转运至溶酶体，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，最后被包裹的胞浆成分在溶酶体酶的作用下被降解，其降解产物在细胞内可被循环利用[8]。因此，观察自噬体的荧光聚积程度可以判断自噬水平的强弱[8]。本试验通过MDC法检测自噬体，结果显示黑果枸杞花青素诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7后自噬体减少，表明黑果枸杞花青素可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬。

mTOR是由高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成，它的主要作用是调控细胞的生长和新陈代谢[9-10]。mTOR激酶活性的降低能促进细胞自噬，进而可以使细胞适应环境的改变，这些改变包括生长缓慢以及分解代谢旺盛[11]。mTOR信号通路是多条信号通路的汇聚点，通过对上、下游信号的传导来影响细胞自噬，现已成为目前研究最多的信号通路。mTOR的上游通路主要是AMPK-mTOR信号通路，AMPK(adenosine 5′-monophosphate activated protein kinase)是细胞中感受能量状态调节代谢的一个蛋白激酶,在自噬发生的调控中也发挥着重要的作用[12]。AMPK磷酸化可以激活mTOR的下游基因ULK1，导致自噬的发生[13]。同时mTOR的磷酸化可以通过抑制ULK1的活性抑制自噬[14]。因此AMPK不仅可以直接激活ULK1而且可以通过负调节mTOR阻断其对ULK1的抑制作用来促进自噬[15]。本试验结果显示，黑果枸杞花青素能显著降低AMPK的mRNA和p-AMPK的蛋白表达水平，能显著增加mTOR的mRNA和p-mTOR的蛋白表达水平，表明其可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬，且可能与AMPK-mTOR通路有关。结合雷帕霉素抑制剂结果表明，黑果枸杞花青素能显著降低AMPK的mRNA和p-AMPK的蛋白表达水平，表明其可能通过抑制AMPK-mTOR 信号通路关键因子AMPK抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬。

综上所述，黑果枸杞花青素可以抑制小鼠巨噬细胞RAW264.7自噬，且可能与AMPK-mTOR 信号通路关键因子AMPK有关。