孙艺学，丛彦龙，李佳新，刘立军

(1.长春大学 吉林省生物医学工程研发中心，吉林 长春 130022；2.吉林大学 动物医学学院，吉林 长春 130062；吉林农业科技学院 动物科技学院，吉林 吉林市 132109)

禽流感是由A型流感病毒感染引起的家禽和野生禽类的高度接触性传染病。作为我国的一种地方流行性传染病，H9N2亚型禽流感自20世纪90年代开始在我国禽群中流行至今。虽然其致死率不高，但常导致家禽呼吸道症状、产蛋率和肉料比下降，且容易引起并发或继发感染，给养禽业造成严重的经济损失[1-4]。疫苗免疫是预防禽流感最经济有效的手段，对提高禽病防制水平，保障养禽业的健康发展具有十分积极的意义。目前国内预防H9N2禽流感的商品化疫苗均为灭活苗[5]。灭活疫苗制备技术有其优点，但亦存在着很大的缺陷。由于禽流感病毒易变异，且双重及多重亚型病毒之间容易发生遗传物质的交换，使灭活疫苗难以应付新的突变型禽流感病毒的感染，致使其长期有效性受到了极大挑战[6]。因此，研制一类能够快速应对禽流感的变异且更安全有效的疫苗至关重要。

由于病毒样颗粒(virus-like particle，VLP)疫苗的免疫效果及其安全性优于灭活疫苗，因而成为近年的研究热点。VLP是由某种病毒的一个或多个结构蛋白自行装配而成的高度结构化的空心蛋白颗粒，不含病毒核酸，无法自主复制，不存在基因重组或重配和毒力回复的可能，不仅安全性高，而且可以模拟病毒粒子的天然结构激活细胞免疫和体液免疫，诱导的免疫保护更为全面[7]。同时，利用杆状病毒表达系统在昆虫悬浮细胞中能够大规模生产VLPs。由于杆状病毒表达系统不依赖鸡胚生产，能够保证禽流感大流行时疫苗的充足供应，且具有成本低、对环境友好、生产周期短、安全性高等优势，因此利用杆状病毒表达系统生产的VLP疫苗具有较大的应用潜力。

为了应对近年来G57基因型H9N2亚型禽流感在我国禽群中的普遍流行，本研究在利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建了由G57基因型H9N2禽流感病毒的HA和M1蛋白组装而成的VLPs的同时，还利用该系统包装了相应的HA蛋白和小鼠白血病病毒gag蛋白的VLPs。通过Western blot、血凝试验和透射电镜形态学观察等方法对纯化后的VLPs进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 病毒、质粒、细胞、抗体A/chicken/Jilin/DH109/2012、pFastBac1、pFastBac1-gag、感受态细胞DH5α和DH10Bac、昆虫细胞Sf9、鸡抗H9N2亚型禽流感病毒高免血清和鼠抗小鼠白血病病毒gag蛋白阳性血清均为实验室保存。

1.2 主要试剂LA Taq DNA Polymerase、BacPAK杆状病毒快速滴定试剂盒购自TaKaRa公司； BamHⅠ和Hind Ⅲ购自NEB公司；Trans2K plus DNA Marker、T4DNA连接酶、X-gal、BCA蛋白测定试剂盒购于北京全式金生物技术有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、EasyPure®HiPure Plasmid提取试剂盒、病毒RNA/DNA基因组提取试剂盒购自康宁公司；Lipo3000 Transfection Reagent为Invitrogen公司产品；昆虫无血清培养基Sf-900TMⅡ为Gibco公司产品；胎牛血清购自BI公司；PAGE凝胶快速制备试剂盒购于上海雅酶生物有限公司；羊抗小鼠IgG/HRP、兔抗鸡IgG/HRP购于北京博奥森生物技术有限公司；蛋白Marker购于Thermo公司。

1.3 重组穿梭质粒的构建根据NCBI网站中H9N2亚型禽流感毒株A/chicken/Jilin/DH109/2012的HA(GenBank登录号：KF886409)和M1(GenBank登录号：KF886412)的基因序列，分别设计1对特异性扩增引物(表1)。提取病毒的RNA并对目的基因片段进行扩增。利用T4DNA连接酶将HA和M1等基因片段分别与pFastBac1载体于25℃连接30 min后转化至DH5α感受态细胞中。用含有100 mg/L氨苄青霉素和100 mg/L庆大霉素的选择培养基筛选阳性菌落。利用质粒小提试剂盒提取重组穿梭质粒并送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序鉴定。

表1 引物序列及相关信息

1.4 重组杆粒的构建将测序正确的3种重组穿梭质粒pFastBac1-HA、pFastBac1-M1和pFastBac1-gag分别转化至DH10Bac感受态细胞中，加入无抗性LB后，置于30℃振荡培养3 h进行同源重组。取适量菌液涂布于含有100 mg/L卡那霉素、50 mg/L庆大霉素、70 mg/L四环素、24 g/L IPTG和20 g/L X-gal的三抗固体筛选培养基上，于37℃避光培养24 h后挑取白色单菌落，分别使用特异性引物和M13通用引物进行重组杆粒的菌落PCR鉴定。将鉴定为阳性的菌落接种于三抗液体LB培养基，于30℃振荡培养3 h，然后在三抗固体筛选培养基上进行第2次划线筛选，置于37℃培养箱中避光培养24 h，连续进行3次筛选以获得阳性杆粒。

1.5 重组杆状病毒的构建利用脂质体介导转染法，参照Invitrogen公司的Lipo3000说明书，将重组杆粒rBacmid-HA、rBacmid-M1和rBacmid-gag分别转染至Sf9昆虫细胞。按照病毒基因组提取试剂盒说明书，分别提取P4代重组杆状病毒的基因组，利用表1中的特异性引物及M13通用引物进行重组杆状病毒的PCR鉴定，同时进行Western blot鉴定和血凝活性测定。将收取的P4代重组杆状病毒rBV-HA、rBV-M1和rBV-gag利用BacPAK杆状病毒快速滴定试剂盒进行滴度测定。

1.6 VLPs组装与鉴定将rBV-HA和rBV-M1或rBV-gag以MOI=5共感染细胞密度为2.5×106个/mL的Sf9悬浮细胞，27℃培养96 h后收取细胞悬液，利用蔗糖密度梯度离心进行VLPs纯化，将获得的2种VLPs分别命名为VLP-M1和VLP-gag。通过透射电子显微镜观察、血凝试验和Western blot对两者进行鉴定。

2 结果

2.1 重组穿梭质粒的鉴定以G57基因型H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Jilin/DH109/2012的cDNA为模板，利用表1中的引物扩增其HA和M1基因。将2个基因分别与pFastBac1载体连接构建重组穿梭质粒，通过酶切鉴定以检测目的基因是否正确重组至pFastBac1载体中。如图1所示，所构建的重组穿梭质粒pFastBac1-HA、pFastBac1-gag和pFastBac1-M1的目的基因的酶切产物均与预期大小相符，其中HA、gag和M1基因大小分别为1 701,1 561和759 bp。

2.2 重组杆粒的鉴定将重组穿梭质粒pFastBac1-HA、pFastBac1-gag和pFastBac1-M1经同源重组后，经过连续3次抗性筛选获取阳性菌液，提取重组杆粒进行PCR鉴定。如图2A的1%琼脂糖凝胶电泳分析所示，利用基因特异性引物进行的PCR扩增结果均与预期大小相符。用M13引物扩增目的基因的鉴定结果如图2B所示，其中含有HA基因片段的扩增产物大小约为4 050 bp，gag片段大小约为3 788 bp，M1片段大小约为3 116 bp，均与预期大小相符。将鉴定正确的阳性重组杆粒分别命名为rBacmid-HA、rBacmid-gag和rBacmid-M1。

A.特异性引物PCR鉴定结果;B.M13通用引物PCR鉴定结果;M.Trans2K plus DNA Marker；1.rBacmid-HA；2.rBacmid-gag；3.rBacmid-M1图2 重组杆粒的PCR鉴定电泳结果

2.3 重组杆状病毒的鉴定

2.3.1重组杆状病毒感染Sf9细胞的病变观察 将重组杆粒rBacmid-HA、rBacmid-gag和rBacmid-M1分别转染Sf9细胞，盲传后在倒置显微镜下可见到Sf9细胞体积变大、内部呈颗粒化、细胞核破裂等细胞病变效应(图3)。将3种重组杆状病毒分别命名为rBV-HA、rBV-gag和rBV-M1。

A.正常Sf9细胞；B.rBV-HA感染组；C.rBV-gag感染组；D.rBV-M1感染组图3 重组杆状病毒的致细胞病变效应

2.3.2重组杆状病毒的基因组鉴定 分别收取盲传后的P4代重组杆状病毒液200 μL，按照病毒基因组提取试剂盒的说明书，提取其基因组，分别利用特异性引物和M13通用引物进行PCR鉴定，如图4的1%琼脂糖凝胶电泳结果所示，扩增产物均与2.2中的目的基因条带大小相符。

A.特异性引物PCR鉴定结果;B.M13通用引物PCR鉴定结果;M.Trans2K plus DNA Marker；1.rBV-HA；2.rBV-gag；3.rBV-M1图4 重组杆状病毒基因组的PCR鉴定电泳结果

2.3.3重组杆状病毒感染Sf9细胞后的目的蛋白表达鉴定 收集重组杆状病毒感染后的Sf9细胞的上清液，与蛋白上样缓冲液5∶1混匀，煮沸离心后制备成样品进行Western blot鉴定。结果如图5所示，在PVDF膜上的HA、gag和M1条带大小分别约为63,55，27 kDa，目的相对蛋白分子质量均与预期大小相符。

M.蛋白质分子量标准；1.rBV-HA；2.rBV-M1；3.rBV-gag图5 重组杆状病毒表达目的蛋白的Western blot鉴定

2.3.4重组杆状病毒的血凝活性测定 收集P4代重组杆状病毒感染的Sf9细胞的上清液，离心后取上清进行血凝试验。结果如图6所示，P4代rBV-HA的血凝滴度可达24。

图6 rBV-HA感染Sf9细胞血凝活性测定结果

2.3.5重组杆状病毒滴度测定 采用BacPAK杆状病毒快速滴定试剂盒对P4代重组杆状病毒进行滴度测定。结果显示，rBV-HA、rBV-gag和rBV-M1的病毒滴度分别为3.47×107,3.35×107和3.21×107PFU/mL。

2.4 VLPs的鉴定

2.4.1VLPs的形态观察 分别将P4代重组杆状病毒rBV-HA和rBV-gag，以及rBV-HA和rBV-M1同时感染Sf9悬浮细胞，96 h后将感染细胞置于28℃、120 r/min摇床培养。在此过程中，结构蛋白在宿主细胞中分别表达后会自行组装，组装后的VLPs会分泌到细胞培养上清中。取少量经蔗糖密度梯度离心纯化后的VLP-gag和VLP-M1进行透射电子显微镜观察，在VLP-gag的视野中可见直径约150 nm、有囊膜且空心化的VLPs(图7A)，而VLP-M1的粒子直径约为100 nm(图7B)，与天然流感病毒粒子的大小相符。此外，2种VLPs表面均具有明显的纤突样蛋白结构。

2.4.2VLPs的血凝活性检测 由于禽流感病毒的HA蛋白具有凝集红细胞的特性，本研究中的VLPs如果构建成功也会展示HA蛋白，因此也应具有血凝活性。据此，取纯化后的VLPs各50 μL进行血凝活性检测。如图8,9所示，VLP-gag和VLP-M1的血凝滴度分别为28和27。

A.VLP-gag;B.VLP-M1图7 透射电镜下VLPs的形态观察

图8 VLP-gag的血凝活性检测结果

图9 VLP-M1的血凝活性检测结果

2.4.3VLPs的Western blot鉴定 为了进一步鉴定所制备的VLP-gag和VLP-M1是否在昆虫细胞-杆状病毒表达系统组装成功，通过Western blot对它们的目的蛋白组分进行鉴定。如图10所示，用鸡抗H9N2亚型禽流感病毒高免血清和鼠抗小鼠白血病病毒gag蛋白阳性血清，Western blot同时检测到了与预期大小相符的HA和M1或gag蛋白条带，证明VLP-gag和VLP-M1均由相应的目的蛋白组装而成。

M.蛋白质分子量标准；1.VLP-M1；2.VLP-gag图10 VLPs蛋白组分鉴定

3 讨论

流行病学调查研究显示，从2010年起，G57基因型已经发展成为我国H9N2亚型禽流感病毒的优势基因型[8]。免疫是预防禽流感的有效防控手段。由于VLPs的安全性和免疫原性优于灭活苗，因此成为新型疫苗的研制热点。当前利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统构建VLPs的技术已经非常成熟，但是其生产成本要比灭活疫苗等传统疫苗高许多。对于兽用疫苗，疫苗的生产成本是本研究重点考虑的因素。

病毒粒子的形状和大小主要取决于基质或衣壳蛋白的直径。由于小鼠白血病病毒粒子的平均直径为150～180 nm，明显大于流感病毒的粒子直径(80～120 nm)[9]，预示着如果利用gag作为流感病毒VLPs的骨架蛋白，产生的VLPs将具有更大的表面积，由此有望容纳更多的流感病毒的主要保护性抗原蛋白，即病毒表面的纤突蛋白—HA和NA。由gag和HA和/或NA组装产生的VLPs，可以使HA和/或NA尽可能多地嵌入到gag蛋白上，由此提高免疫原的含量，进而产生更好的免疫效果。据此，本研究将H9N2亚型禽流感病毒的最主要保护性抗原—HA蛋白和该病毒的基质蛋白M1或小鼠白血病病毒的gag蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中进行了自我组装，构建了基质蛋白不同来源的两种VLPs，分别命名为VLP-M1和VLP-gag。利用蔗糖密度梯度离心对纯化后的VLPs进行透射电镜观察，在视野中可见两种VLPs的形态结构与野生型H9N2亚型禽流感病毒非常相似，其中装配有gag蛋白的VLPs的直径大小约为150 nm，明显大于VLP-M1的粒子大小(约100 nm)。血凝试验结果显示，所构建的VLP-gag比VLP-M1提高了一个血凝滴度，表明VLP-gag颗粒表面镶嵌的HA蛋白数量多于VLP-M1。Western blot鉴定结果进一步证实，在VLP-M1和VLP-gag中均可以同时检测到HA和M1或gag，表明目的蛋白在昆虫细胞-杆状病毒表达系统中进行了成功组装。上述鉴定结果表明，VLP-gag和VLP-M1构建正确，VLP-gag的表面积大于VLP-M1，前者的血凝活性高于后者，由此实现了本研究的预期设计目标。

总之，本研究昆虫细胞-杆状病毒表达系统同时构建了基质蛋白不同来源的、可以展示G57基因型H9N2亚型禽流感病毒主要免疫原—HA蛋白的两种VLPs，为下一步比较VLP-gag和VLP-M1的免疫原性和免疫保护效果奠定了基础。此外，由于VLP-gag免疫后仅能刺激机体产生特异性的H9N2亚型禽流感病毒的HA抗体和小鼠白血病病毒的gag抗体，而不会产生针对H9N2亚型禽流感病毒的PB2、PB1、PA、NP、NA、M和NS等抗体，所以可以利用它作为标记疫苗用于区分临床上H9N2亚型禽流感病毒的野毒感染和灭活疫苗免疫，从而有望为H9N2亚型禽流感的净化提供技术支持。