唐亦然，戴鑫钧，胡燕萍，毕斯琪，孟祥苗，杨 杨，宋厚辉

(浙江农林大学 动物科技学院/动物医学院 浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室，浙江 杭州 311300)

尽管结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)早在100多年前就被发现，但其所造成的结核病仍持续流行，成为了全球性公共卫生问题，对人类的健康造成严重危害[1]。6 kDa早期分泌抗原靶标(6-kDa early secretory antigenic target，ESAT-6) 是MTB独有分泌系统ESX-1分泌的小分子蛋白，该基因位于MTB RD-1区的开放阅读框的Rv3875处[2-3]。RD-1区仅存在于致病性分枝杆菌中，包括MTB、牛分枝杆菌、非洲分枝杆菌等，而不存在于所有减毒BCG疫苗株中，其与毒力密切相关[4]。作为MTB重要的毒力因子，ESAT-6参与MTB的致病过程，包括促进MTB在宿主细胞内复制与细胞间的扩散、诱导细胞凋亡发生、成孔和裂解膜、引起Ⅰ型IFN释放等[5]。ESAT-6可以增加细胞内Ca2+的浓度，促进活性氧(ROS)的产生，从而触发内质网的激活，调控内质网介导的下游信号通路eIF2a/ATF4/CHOP引起细胞凋亡的发生[6-7]。另外，ESAT-6具有成孔功能，可以导致细胞中吞噬溶酶体的破裂，从而使MTB从吞噬体向细胞质转运，从而激活一系列的胞内反应[8-9]。

本试验首次采用Tet-On 3G诱导表达系统中的反应质粒pLVX-TRE3G和调控质粒pLVX-Tet3G，将ESAT-6基因和红色荧光蛋白mCherry融合插入到pLVX-TRE3G中，与调控质粒pLVX-Tet3G分别包装成慢病毒后感染THP-1细胞，在Puromycin和G418双重压力下筛选可经Dox诱导表达ESAT-6的细胞系，并分析不同浓度的Dox和不同诱导的时间对THP-1中ESAT-6表达的影响以及诱导表达蛋白ESAT-6的生物活性功能，为深入研究ESAT-6在MTB感染中的作用机制奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料大肠杆菌DH5α由本实验室保存。质粒pLVX-TRE3G、pLVX-Tet3G、pMD2.0G和psPAX2购自长沙优宝生物科技有限公司。真核表达质粒pmCherry-ESAT-6为本试验自行构建，在质粒pmCheryy-N1的基础上插入了MTBESAT-6基因片段。限制性内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ购自NEB公司；DL2000 DNA Marker、DNA连接酶购自TaKaRa公司；DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix购自南京诺维赞生物科技有限公司；转染试剂Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；强力霉素(Doxycycline，Dox)、嘌呤霉素(Puromycin)、G418购自Sigma-Aldrich公司；南美胎牛血清(FBS)和细胞培养基(DMEM、1640)购自Gibco公司；HRP标记的山羊抗鼠 IgG、山羊抗兔 IgG以及Human IL-1β ELISA试剂盒购自上海优宁维公司；mCherry单克隆抗体购自Abcam公司；脂多糖LPS和尼日利亚菌素Nigericin；CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒购自Promega。

1.2 细胞培养人肾上皮细胞HEK-293T用含有10%的胎牛血清的DMEM培养基培养，人单核细胞THP-1用含有10%的胎牛血清的1640培养基培养，均置于含有5% CO2的37℃培养箱中。

1.3 mCherry-ESAT-6融合基因的扩增以实验室构建的质粒pmCherry-ESAT-6为模板，设计特异性引物(序列如表1所示)用来PCR扩增ESAT-6和荧光标签mCherry的融合片段。反应体系如下：DNA模板1 μL，2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O补足至50 μL。设置PCR反应条件如下：预热94℃ 3 min，变性94℃ 30 s，退火60℃ 30 s，延伸68℃ 30 s，循环35次，延伸68℃ 7 min。经1%琼脂糖核酸电泳验证PCR产物。

表1 引物序列

1.4 重组质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6的构建使用限制性内切酶SmaⅠ和EcoRⅠ酶切质粒pLVX-TRE3G以及 ESAT-6基因的PCR产物，37℃孵育4 h。纯化回收酶切产物后，用DNA连接酶16℃连接2 h，转到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，并涂布于含Kana抗性的LB平板上过夜培养。挑取单菌落，经菌落PCR筛选阳性克隆，扩大培养后提取质粒，将重组质粒送至浙江有康生物科技有限公司测序。将测序成功的重组质粒命名pTRE3G-mCherry-ESAT-6。

1.5 重组质粒诱导表达目的蛋白的初步验证将HEK293T细胞以5×105个/mL的细胞密度铺于12孔细胞培养板中，过夜培养。将质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6和pLVX-Tet3G按照质量比 4∶1混合，用Lipofectamine 2000转染试剂转染到细胞中,同时加入100 μg/L的 Dox。转染24 h后，通过荧光显微镜观察荧光表达情况。加入200 μL NP40裂解细胞，收取细胞总蛋白，用10%的分离胶进行SDS-PAGE后，105 V转膜40 min；5%的脱脂奶粉封闭1 h，TBST洗涤3次，5 min/次；用mCherry单克隆抗体(1∶1 000稀释)4℃孵育过夜后，TBST洗涤5次；用 HRP标记的山羊抗兔室温孵育1 h，TBST洗涤3次；用ECL发光底物进行显影曝光。

1.6 慢病毒包装将 HEK293T细胞以5×105个/mL的细胞密度铺于10 cm培养皿中，过夜培养12～16 h。将pTRE3G-mCherry-ESAT-6与慢病毒包装质粒psPAX2和pMD2.0G以2∶2∶1的比例混合后，用Lipofectamine 2000转染上述混合质粒到细胞中，转染3 d后收集含病毒的上清，并且用0.45 μm滤器过滤除菌，所获得病毒命名为LV-TRE3G-ESAT-6。用上述相同方法获取LV-Tet3G慢病毒上清，分装保存于-80℃。

1.7 可诱导表达目的蛋白的THP-1细胞系的筛选与鉴定将THP-1细胞以每孔5×105个/mL的细胞密度铺于6孔细胞培养板中，过夜培养。吸去原有培养基，加入含有病毒的培养基(1 mL培养基中含有6 mg/L的polybrene、50 μL LV-TRE3G-ESAT-6和50 μL LVX-Tet3G)，300 r/min离心1 h后，再加入1 mL培养基(含有6 mg/L的polybrene)。感染第2天换掉含病毒的培养基，待感染72 h后，换含有1 mg/L Puromycin和800 mg/L G418的新鲜完全培养液，同时设置空白对照。每2～3 d更换1次含有抗生素的培养基，直到空白组细胞全部死亡。阳性细胞克隆扩大培养、传代、冻存，将所获得的细胞株命名为THP-1/ESAT-6。将THP-1/ESAT-6细胞铺于24孔细胞培养板中，添加100 μg/L的Dox诱导剂，培养24 h后，提取细胞的总蛋白，Western blot检测 ESAT-6表达情况。加入不同浓度的Dox培养24 h或者用100 μg/L的Dox培养不同时间后，Western blot检测 ESAT-6的表达与诱导剂浓度和作用时间的关系。

1.8 可诱导表达目的蛋白的THP-1细胞系稳定性检测为了检测不同代次细胞系的ESAT-6蛋白的表达稳定性，在将细胞传至第2,8,14和20代时分别铺于24孔细胞培养板中，添加100 μg/L的Dox，诱导表达24 h后进行Western blot检测 ESAT-6的表达。

1.9 可诱导表达目的蛋白的生物活性检测将筛选获得的细胞系THP-1/ESAT-6铺于96孔细胞培养板中， 加入100 μg/L的Dox分别处理6，9，12，18，24，36和48 h后，通过CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay试剂盒测定细胞的存活率。此外将THP-1/ESAT-6细胞铺于24孔细胞培养板中，添加100 μg/L的Dox诱导剂培养20 h后，加入脂多糖1 mg/L LPS刺激细胞3 h，10 μmol/L尼日利亚菌素Nigericin作用1 h后，收集细胞上清，通过ELISA试剂盒检测细胞上清中的IL-1β的分泌情况。

2 结果

2.1 ESAT-6基因的PCR扩增以实验室构建的真核表达质粒pmCherry-ESAT-6为模板，PCR扩增ESAT-6和mCherry融合片段，预期片段大小为1 107 bp。PCR扩增产物经过 1%的琼脂糖凝胶电泳检测，与预期片段大小基本一致(图1)。

2.2 pTRE3G-mCherry-ESAT-6 重组质粒的构建双酶切ESAT-6和mCherry融合片段后，使用DNA连接酶将其插入载体pLVX-TRE3G上，转入大肠杆菌DH5α中。挑选23个单菌落克隆，经菌落PCR验证获得5个阳性克隆(图2)。将阳性克隆扩增，提取质粒送往公司进行测序验证，结果表明出入的基因片段与已公布的基因序列完全相同，这说明重组质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6构建成功。

M.DL2000 DNA Marker；1.ESAT-6基因片段图1 mCherry-ESAT-6 基因的PCR扩增

2.3 重组质粒诱导表达ESAT-6的初步验证将质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6和pLVX-TRE3G分别与调控质粒pLVX-Tet3G按质量比4∶1共转染HEK293T细胞，并加入 100 μg/L的Dox诱导24 h后，荧光显微镜下观察荧光表达情况，并收集细胞蛋白进行 Western blot分析。结果表明，pTRE3G-mCherry-ESAT-6和 pLVX-Tet3G共转时，Dox可以诱导细胞发出红色荧光，并且Western blot可检测到ESAT-6的表达(图3)，这说明重组质粒pTRE3G-mCherry-ESAT-6可用于后续的试验。

M.DL2000 DNA Marker；1.阴性对照；2～24.待验证的菌落图2 菌落PCR鉴定

A.荧光显微镜观察荧光表达情况；B.Western blot检测ESAT-6蛋白表达情况图3 重组质粒在HEK293T细胞中诱导表达ESAT-6

2.4 可诱导表达的 THP-1/ESAT-6细胞系稳定性筛选与鉴定用慢病毒LV-TRE3G-ESAT-6和LV-Tet3G按照一定的比例感染THP-1细胞，并用Puromycin和G418双重压力筛选获得稳定细胞THP-1/ESAT-6，对不同细胞代次用Dox进行诱导，提取细胞的总蛋白进行Western blot分析。结果表明，筛选获得的THP-1/ESAT-6细胞在 Dox的诱导下可检测到ESAT-6的表达，未诱导组未检测到ESAT-6表达(图4)，这表明THP-1/ESAT-6细胞系构建成功,且能够稳定表达ESAT-6。

图4 不同细胞代次Dox诱导THP-1/ESAT-6细胞稳定表达ESAT-6

2.5 ESAT-6表达与Dox质量浓度和诱导时间的关系用不同质量浓度的 Dox(0，100，200，400，600和800 μg/L)处理THP-1/ESAT-6细胞，在诱导24 h 后收集细胞蛋白，采用Western blot方法检测 ESAT-6的表达。结果表明ESAT-6的表达随着Dox质量浓度的增加而增加，呈正相关性(图5)。用100 μg/L的Dox处理细胞，分别在0，6，9，12，18，24，36，48，60和72 h后检测 ESAT-6表达情况。结果表明Dox诱导9 h后可明显检测到ESAT-6，并且ESAT-6的表达具有时间依赖性(图6)。

A.Western blot检测不同质量浓度的Dox诱导ESAT-6表达情况；B.灰度分析图5 Dox质量浓度对THP-1/ESAT-6细胞中ESAT-6表达的影响

A.Western blot检测Dox不同诱导时间下ESAT-6表达情况；B.灰度分析图6 Dox诱导时间对THP-1/ESAT-6细胞中ESAT-6表达的影响

2.6 可诱导表达目的蛋白的生物活性检测有研究发现MTB ESAT-6能够引起NLRP3炎症小体的激活介导IL-1β的分泌从而促进细胞死亡[10]。为了验证诱导表达ESAT-6蛋白对细胞存活的影响，本试验用100 μg/L的Dox处理细胞，分别在0，6，9，12，18，24，36 和48 h后检测细胞的存活率。结果表明Dox诱导18 h后细胞的存活率显著下降(图7A)，说明随着Dox诱导时间的增加ESAT-6的表达的增强可以促进细胞的死亡。此外，为了验证诱导表达ESAT-6蛋白对NLRP3激活剂Nigericin(Nig)所引起的IL-1β分泌的影响，使用100 μg/L的Dox诱导剂培养THP-1/ESAT-6细胞20 h后，再加入1 mg/L脂多糖LPS刺激细胞3 h，10 μmol/L尼日利亚菌素Nigericin作用1 h，通过ELISA检测细胞上清IL-1β的变化。结果表明ESAT-6能够促进由尼日利亚菌素Nigericin引起的IL-1β的分泌(图7B)。这些结果表明诱导表达蛋白ESAT-6具有促进IL-1β的分泌产生和细胞死亡的生物活性。

3 讨论

ESAT-6是MTB的免疫优势抗原和主要的毒力因子，参与调控宿主细胞的多种固有免疫反应。有研究表明MTB ESAT-6能够介导NLRP3炎症小体的激活，触发下游因子Caspase-1的活化，从而促进IL-1β的分泌和细胞焦亡的发生[10-11]。ESAT-6还能够触发I型干扰素的产生，这主要是通过激活STING-TBK1-IRF3信号转导轴特异性激活配体导致的[5]。目前，对ESAT-6功能的研究主要通过蛋白纯化表达和缺失菌株的构建来完成。通过大肠杆菌原核表达所获得的ESAT-6蛋白中往往含有大肠杆菌本身的菌体物质，如脂多糖(LPS)，或者含有在纯化过程中添加的去污剂。然而，这些物质的存在有时会造成试验结果出现误差。多项研究报道发现ESAT-6以酸性pH依赖性方式诱导脂质泄露，具有膜溶解的功能[12-13]。但是，CONRA等[14]发现ESAT-6本身不具备溶解细胞膜的功能,之前的研究发现ESAT-6之所以能够溶剂细胞膜，完全归因于ESAT-6中残留的去污剂ASB-14。因此，本试验通过Tet-On 3G系统构建可诱导表达ESAT-6的细胞系，避免大肠杆菌菌体物质和去污剂等造成的影响。

A.ELISA检测Dox对LPS+Nig引起THP-1/ESAT-6细胞中IL-1β分泌的影响；B.Dox不同诱导时间对THP-1/ESAT-6细胞存活的影响图7 可诱导表达ESAT-6蛋白的生物活性鉴定

Tet-On 3G系统对Dox具有相当高的特异性和敏感度，且Tet毒性低，不影响细胞内的其他基因活性。并且，Tet-On 3G系统诱导基因表达的效果与Dox的浓度及诱导时间存在一定的关系，可以自由控制靶基因表达的时间和强度[15]。鉴于Tet-On 3G系统的上述特性，本试验中利用该系统构建了可诱导表达ESAT-6蛋白的THP-1细胞。当未加入Dox的条件下，THP-1细胞不表达ESAT-6；当加入Dox时，THP-1细胞可诱导表达ESAT-6，并且100 μg/L 的Dox诱导6 h即可观察到ESAT-6的表达，诱导9 h后ESAT-6表达量明显上升，在36 h达到最大值，此后表达量保持稳定。

THP-1分化的巨噬细胞是研究MTB的主要体外细胞模型。THP-1细胞是典型的悬浮细胞，其转染并瞬时表达外源蛋白相对比较困难。Lipofectamine 2000对THP-1毒性较大，转染效率极低，不适合THP-1细胞转染。腺病毒对THP-1细胞毒性较低，并且具有极高的转染效率，但腺病毒免疫原性较高，高MOI极大影响THP-1细胞免疫状态，有影响后续试验的风险。相比腺病毒来说，慢病毒同样对THP-1的毒性较低，但其转染效率有所降低[16]。不过，它具有较低的免疫原性，对细胞免疫状态的影响小。考虑3种转染方式的优缺点，本试验包装了LV-TRE3G-ESAT-6和LV-Tet3G这2种慢病毒用以感染THP-1细胞。

综上，本试验首次采用Tet-On 3G诱导表达系统成功构建了由Dox稳定诱导表达ESAT-6的THP-1细胞系，分析了不同诱导浓度和诱导时间对ESAT-6表达量的影响以及ESAT-6的生物活性，为探究ESAT-6功能提供了新的试验方法，也为深入探究ESAT-6参与MTB调控细胞通路的作用机制奠定了基础。