任小宁 房昆 郑皆炜

资料与方法

1 一般资料

1.1 标本来源：患者男，汉族，45岁，无输血史，2020年9月26日因休克就诊于我院急诊外科，血红蛋白（Hb）114 g/L、血细胞比容（Hct）34.2%，申请备血。采集外周静脉血各2 mL，EDTA抗凝待检。

1.2 试剂与仪器：单克隆抗-A、抗-B标准血清、抗-A1、抗-H抗体试剂（上海血液生物医药有限公司，批号分别是20191018、20200522、20191121）、抗-AB抗体试剂（法国Diagast公司，批号837000），ABO标准红细胞（上海血液生物医药有限公司，批号20205324），筛选细胞（上海血液生物医药有限公司，批号20207030），DG Gel ABOCDE卡（西班牙戴安娜公司，批号19025.01），奥森多双人份血型卡（ORTHO公司，批号07880），基因组DNA提取试剂盒、第6和第7外显子 ( Exon6和Exon7）直接测序引物（PAGE级）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成 ，克隆测序试剂，LA-Taq酶及载体（pMD18-T vector）（日本TaKaRa公司产品），所有试剂均在有效期内使用。凝胶微柱卡孵育器（西班牙DIANA公司）、全自动血型分析仪（ORTHO公司）贝索离心机和ABI3100基因测序仪（美国应用生物系统公司）等。

2 方法

2.1 红细胞ABH抗原检测：采用强生全自动血型分析仪及IgG抗人球单人份血型卡，检测患者ABO抗原，后采用试管法复核：患者全血标本离心备用，取压积红细胞洗涤三次，室温条件下使被检者红细胞分别与抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB和抗-H单抗反应, 鉴定其 ABH 抗原。

2.2 血浆ABO血型抗体及不规则抗体检测：采用试管法，使血浆与标准A、B、O型红细胞反应，检测ABO血型抗体；采用微柱凝胶抗球蛋白试验，使血浆与抗筛细胞反应，检测不规则抗体。

2.3 DNA提取：按《DNA 提取试剂盒说明书》提取DNA，DNA定量分析后调整浓度为（20～30）ng/μL，A260/A280比率在1.6～1.9，4℃保存备用。

2.4 ABO基因Exon6、7直接测序

扩增引物分别为：

PCR扩增反应体系：dNTP 400 μmol/L，模板DNA 500 ng，引物0.1 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，Taq酶3 U，终反应体系为50 μL。……