任小宁 房昆 郑皆炜

资料与方法

1 一般资料

1.1 标本来源：患者男，汉族，45岁，无输血史，2020年9月26日因休克就诊于我院急诊外科，血红蛋白（Hb）114 g/L、血细胞比容（Hct）34.2%，申请备血。采集外周静脉血各2 mL，EDTA抗凝待检。

1.2 试剂与仪器：单克隆抗-A、抗-B标准血清、抗-A1、抗-H抗体试剂（上海血液生物医药有限公司，批号分别是20191018、20200522、20191121）、抗-AB抗体试剂（法国Diagast公司，批号837000），ABO标准红细胞（上海血液生物医药有限公司，批号20205324），筛选细胞（上海血液生物医药有限公司，批号20207030），DG Gel ABOCDE卡（西班牙戴安娜公司，批号19025.01），奥森多双人份血型卡（ORTHO公司，批号07880），基因组DNA提取试剂盒、第6和第7外显子 ( Exon6和Exon7）直接测序引物（PAGE级）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成 ，克隆测序试剂，LA-Taq酶及载体（pMD18-T vector）（日本TaKaRa公司产品），所有试剂均在有效期内使用。凝胶微柱卡孵育器（西班牙DIANA公司）、全自动血型分析仪（ORTHO公司）贝索离心机和ABI3100基因测序仪（美国应用生物系统公司）等。

2 方法

2.1 红细胞ABH抗原检测：采用强生全自动血型分析仪及IgG抗人球单人份血型卡，检测患者ABO抗原，后采用试管法复核：患者全血标本离心备用，取压积红细胞洗涤三次，室温条件下使被检者红细胞分别与抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB和抗-H单抗反应, 鉴定其 ABH 抗原。

2.2 血浆ABO血型抗体及不规则抗体检测：采用试管法，使血浆与标准A、B、O型红细胞反应，检测ABO血型抗体；采用微柱凝胶抗球蛋白试验，使血浆与抗筛细胞反应，检测不规则抗体。

2.3 DNA提取：按《DNA 提取试剂盒说明书》提取DNA，DNA定量分析后调整浓度为（20～30）ng/μL，A260/A280比率在1.6～1.9，4℃保存备用。

2.4 ABO基因Exon6、7直接测序

扩增引物分别为：

PCR扩增反应体系：dNTP 400 μmol/L，模板DNA 500 ng，引物0.1 μmol/L，Mg2+2.5 μmol/L，Taq酶3 U，终反应体系为50 μL。

PCR扩增反应程序如下: 95℃预变性 10 min；94℃ 60 s，63℃ 90 s，72℃ 60 s，共10个循环；94℃ 60 s，61℃90 s，72℃ 60 s，25个循环；72℃延伸10 min，10℃保温。扩增产物切胶纯化后，进行正反双向测序，测序引物同扩增引物，并在ABI3100-Avant上进行序列分析。（本部分试验在上海市血液中心输血研究所完成) 。

2.5 ABO基因克隆测序：采用LA-Taq酶对ABO基因Exon 6、7进行PCR扩增，将PCR产物纯化后与pMD18-T载体连接，挑取多个阳性菌落进行序列测定，确定样本的单倍型。

2.6 序列对比和分析：序列分析使用Chromas和Gentle软件进行分析，参照人类红细胞血型基因数据库基因序列进行比对。

结 果

1 血型血清学结果 患者抗筛阴性，存在A抗原减弱；而患者红细胞与抗-H凝集反应（4+）明显强于正常B型细胞（3+），与抗-A和抗-AB反应镜下观察存在弱的混合凝集（凝集红细胞＜10%），血清学表现推测为Aend亚型，需通过基因检测进一步判断。（患者血清学结果见表1）。

表1 患者血型血清学结果

2 ABO基因Exon6、7直接测序结果 ABO基因Exon6、7直接测序结果，外显子6存在c.261delG，c.297A＞G碱基突变；外显子7存在c.467C＞T 、c.646T＞A 、c.681G＞A、c.745C＞T、c.771C＞T和c.829G＞A突变，其中c.467C＞T、c.745C＞T突变为A3.07等位基因特征，c.261delG推断可能为O.01.02等位基因。（见图1）。

图1 患者基因测序图

3 ABO基因Exon6、7克隆测序结果 通过PCR产物的克隆测序，序列经对比发现存在两种单倍型，一种为O.01.02，另外1条单倍型序列与A101标准序列对比，发现c.467C＞T和c.745C＞T突变。经检索基因突变数据库，可以判断其含有A3.07和O.01.02等位基因。

讨 论

ABO亚型是指红细胞或分泌液（分泌到个体）所含A或B抗原量不同的表型[3]。ABO亚型在中国人群里的检出率为0.015%[4]。它们大部分是经血型血清学试验以抗原性弱为主要特征的多种表型，目前由国际输血协会确认的A亚型基因型主要有A2、A3、Ax、Am、Ael、Aw，另外血清学的表现型还有Aint、Aend、Ay等表型[5]。在进行ABO血型鉴定时如果只做正定型,特别容易将亚型误定为O型[6]。

ABO*A3.07等位基因导致的A亚型最早由中国台湾LEI LI等人[7]报道，国内其他地区有相关报道[5，8-10]总结分析ABO*A3.07等位基因导致的A亚型可以表现出A3、Ax、Aend亚型的血清学特征，其中A3表型报道较多[5]。另据报道A3、B3亚型在中国人群ABO血型系统变异型中较为常见[11]。三者血清学特征中Ax血清中通常含有弱的抗-A1,红细胞与抗A弱凝集，与抗AB凝集则较强；A3、Aend亚型最大特征是显微镜下呈现混合视野，区别在于前者有2+混合凝集较强，该患者多次离心后与抗-A和抗-AB反应镜下观察仍为弱的混合凝集（凝集红细胞＜10%），推测其为Aend亚型。 出现这种结果原因可能与本实验室采用的单克隆抗A的抗体效价不同或针对的细胞抗原表位不同有关，也有可能是由于A307血型个体差异的不同致红细胞所表达A抗原量不同有关；并且由于缺乏人源试剂因此无法明确该患者血型具体的分型，只能推测其为Aend亚型。

对ABO亚型的准确鉴定，需根据红细胞与抗-A、抗-A1、抗-B、抗-AB、抗-H的凝集强度、血浆中是否存在抗-A1以及分泌型人的唾液中的A、B、H物质进行区分[12]。患者因病情未采集唾液，由于无法精准分型，需借助分子生物学的方法。通过对患者ABO基因的Exon6 、7进行直接基因测序和克隆测序分析，结果相互验证，可以判断其含有A3.07和O.01.02两个等位基因，分子生物学的应用解决了血清学的局限性。

另外，亚型必须具有遗传基础，并且有明确的血清学特点。因年龄、疾病、妊娠等不可遗传的因素造成的血型改变不能认为是亚型；而对于虽有基因改变,却不影响血清学特点的ABO血型也不能称为亚型[13]。该患者因非本地户籍未做家系研究，但有文献报道A3.07基因在和先证者父亲、先证者以及先证者外甥女三代人中均有检测到，说明该突变基因能够稳定遗传[14]。ABO血型抗原基因并不直接编码ABH抗原，而是编码产生特异性糖基转移酶，并由它们分别将糖分子转移至抗原表位的糖链上而合成 ABO 抗原。ABO糖基转移酶分子链中一些氨基酸的不同，决定了其催化产生的糖分子抗原具有不同的特性和亚型。ABO亚型的形成机制常是在ABO基因的7个外显子及部分内含子区域存在点突变、碱基缺失、替代、插入等造成核苷酸序列的改变[15-16]。ABO*A3.07等位基因中c.745C＞T突变致使第249位氨基酸精氨酸置换为色氨酸（p.Arg259Trp），可能是导致A型糖基转移酶活性降低的主要原因[17]。

ABO血型系统是与临床安全输血关系最为密切的血型，血型鉴定时一定要同时做正、反定型, 可避免亚型的漏检或误判。另外，由于试剂抗体的克隆株不同、实验人员的操作及主观性，在亚型判别上存在差异，同时亚型的基因遗传背景复杂，分子也可能存在异质性[16]。总之一种基因型可对应多种表型[18]。因此，对于怀疑是ABO亚型的患者基因检测是获得亚型的最直接证据，但基因分型预测的血型表型最终还需应用血清学方法进行验证，并对有意愿患者开展家系调查，提供输血安全保障。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突