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RhD血型初检阴性孕妇RHD基因分型及同种免疫研究*

2021-12-22马玲吴敏慧赵芳史丽莉

临床输血与检验 2021年6期
关键词:血型分型试剂盒

马玲 吴敏慧 赵芳 史丽莉

在已知的43个人类红细胞血型系统中,Rh血型系统最为复杂,且可以导致新生儿溶血病(hemolytic disease of fetal and newborn,HDFN)和溶血性输血反应,临床意义仅次于ABO血型系统。其中RhD抗原免疫原性最强,相应的抗D是导致严重HDFN的主要抗体[1]。临床上对于RHD-HDNF的预防措施主要是定期进行抗体筛查,同时及时给予抗D免疫球蛋白治疗。中国人的RhD抗原变异型较多,根据抗原表达数量和性质的差异,大致可分为弱D、部分D以及东南亚常见的Del型等。各种RhD变异型基因背景不一,机体免疫状态及临床风险也不同。例如有观点认为,亚洲型DEL(分子遗传背景为RHD基因exon9 c.1227G>A同义突变)孕妇中,未发现抗D抗体产生,建议该型孕妇可以免去孕期频繁地抗体筛查和抗D免疫球蛋白注射[2-3]。因此,明确各亚型临床意义非常重要,对于孕妇RhD抗原变异型及母婴间同种免疫开展研究,可以为RhD-HDFN的诊断、预防提供重要的实验室指标。

关于RhD阴性孕妇的同种免疫情况已有一些报导[4-6],但是相关资料积累分析还远不够,目前临床对RhD阴性孕妇免疫血液学检测及管理认识有限,操作不统一[7]。本文对2018~2020年至本中心的RhD血型初检阴性孕妇进行RHD基因分型及同种免疫状况分析研究,尤其关注亚洲型DEL的情况,为RHD-HDFN诊断及建立早期干预共识进一步积累相关资料,现报道如下。

资料与方法

1 一般资料 2018年10月~2020年9月于本中心进行产前检查的孕妇108例,年龄21~41(中位数:29)岁;RhD血型初检结果均为阴性,采外周静脉EDTA抗凝血及不抗凝血各约3 mL;经本人知情同意。

2 仪器与试剂 IgG/IgM型抗D试剂(分别为:Sanquin,荷兰;Dominion,加拿大);IgG型抗D试剂、IgM型抗C、抗c、抗E、抗e试剂、抗球蛋白试剂(IgG+C3d)、筛选细胞及谱细胞(上海血液生物医药有限责任公司,中国);基因组DNA提取试剂盒(原平皓公司,中国);2×Taq PCR Mix(博尔迪生物,中国);人类红细胞RHD基因分型试剂盒(PCR-SSP)(天津秀鹏生物技术,中国);上述试剂均在有效期内使用。Labofuge 400R低温高速离心机(Heraeus Corp. 德国);血型血清学专用离心机(久保田,日本);ND-100-Spectrophotometer DNA定量分析仪(NanoDrop Corp. 美国);Alphalmager HP凝胶成像系统(Applied Biosystem,美国)。

3 方法

3.1 Rh表型鉴定:使用3种不同厂家IgG或IgM/IgG型抗D试剂,采用盐水或间接抗人球试验的方法进行RhD阴性确认。采用IgM型抗C、抗c、抗E、抗e试剂,分别进行RhCcEe表型鉴定。

3.2 抗体筛查及鉴定:按照常规血清学方法,采用盐水法及间接抗人球方法对患者血清进行意外抗体筛选;对于抗体筛查阳性者进行抗体鉴定试验;同时采用倍比稀释法进行抗体效价测定,参考文献[8]方法,以“1+”凝集的最高稀释度管为滴定终点,记录效价值。

3.3 DNA提取及RHD基因分型:离心吸取孕妇白膜层细胞,按照DNA提取试剂盒操作要求,提取基因组DNA。所有样本采用商品化RHD阴性鉴定基因检测试剂盒(PCR-SSP法)进行RHD基因分型,根据说明书,该试剂盒可以有效地鉴定RHD*01N.01、RHD*01N.03、RHD*15、亚洲型DEL及RHD*06.03.01型。PCR反应条件为: 96℃ 2 min,随即96℃ 20 s,68℃ 60 s,5个循环;96℃ 20 s,65℃ 50 s,72℃ 45 s,10个循环;96℃ 20 s,62℃ 50 s ,72℃ 45 s,15个循环;72℃,5 min,最后4℃保存。PCR扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳(100 V,30 min),用凝胶成像系统分析结果。

3.4 RHD基因测序:对于血清学与基因分型结果有疑问的标本,进一步进行测序分析。参考文献方法[9],对RHD基因10个外显子进行测序分析,测序引物同扩增引物,均由上海生工生物工程股份有限公司合成。 PCR总体积为20 μL,引物浓度为200 nM,PCR条件为:95℃,5 min;95℃,30 s;61℃,30 s;72℃,1 min;35个循环后72℃,10 min;4℃。PCR产物由上海生工生物工程股份有限进行测序。使用Sequencing Analysis 6和SeqScape v3.0软件进行测序图谱分析和序列比对(参考序列:NG007494)。

结 果

1 Rh表型血清学结果 RhD血型初检为阴性的108例样本中,其中有6例RhD确认试验为阳性,102例为阴性。Rh分型结果共检出ccee 61例、Ccee 37例、CCee 4例、ccEe 3例、CcEe 2例及ccEE 1例,见表1。

表1 RHD血清学及基因分型结果

2RHD基因分型结果 108例样本中,存在不同的等位基因,参见表1。其中67例为RHD*01N.01,23例亚洲型DEL,10例RHD*01N.03型,2例RHD*06.03.01型,3例RHD*15。对于血清学与基因分型结果有疑问的3例标本,进行RHD基因10个外显子测序,结果发现一例RHD*05.03型,在exon5上存在c.667 T>G 、c.676 G>C 、c.697 G>C 、c.712 G>A突变 ;一例RHD*01N.25,在introne2最后一位碱基发生c.336-1G>A突变;另发现一例新等位基因,在exon4上存在c.509 T>G突变,见图1。

图1 一例c.509 T>G突变测序图

3 意外抗体筛查结果 108例样本中,共计11例样本检出意外抗体,另有2例在注射抗D免疫球蛋白后,短期内进行抗体筛查,检出低效价抗D ,未纳入统计。参见表2。检出的意外抗体均为Rh系统,其中10例为抗D,1例为抗D合并抗C;在多次检测者中,随着孕期增加,抗体由阴转阳或效价有增高趋势。11例个体中,其中9例为RHD*01N.01,1例为RHD*01N.03,1例为RHD*06.03.01。

表2 意外抗体筛查结果

讨 论

中国汉族人群中RhD阴性表型比例较低,约0.4%左右[10],加上初次妊娠产生抗D抗体几率不大,因此对于RhD-HDFN预防、监测和治疗等并未引起足够重视,常规抗D免疫球蛋白针剂也无法正常获取,但是我国人口基数庞大,RhD阴性围产妇绝对数量并不少,加之目前三胎政策的实施,增大了免疫几率,因此,RhD母胎间同种免疫研究成为围产学及输血医学领域中不容忽视的问题。

本次研究采用商品化试剂盒(PCR-SSP法)进行基因分型研究,在RhD血型初检为阴性108例样本中,发现存在不同的RHD等位基因,最常见的为RHD*01N.01(62.0%,67/108),其次为亚洲型DEL(21.3%,23/108)及RHD*01N.03型(9.3%,10/108);另检出2例RHD*06.03.01(1.9%,2/108);3例RHD*15(2.8%,3/108)。结合血清学结果,剩余3例样本可能含有其他或未知的等位基因,不适用该试剂盒,因此采用测序方法,检出1例RHD*05.03型;1例RHD*01N.25型,在introne2最后一位碱基发生c.336-1G>A突变,该突变位于剪切点位置,可能导致mRNA的正常拼接或拼接效率。另发现一例新的等位基因,在exon4上存在c.509 T>G突变(Genbank:MW923730),该突变的意义有待进一步研究。由于本研究未进行RH盒子型分析,因此对上述基因分型结果,例如RHD*01N.03、RHD*06.03.01等,并不能明确是纯合突变,还是杂合突变。

正常红细胞表面RhD抗原数量约(1.0~3.3)×104个/红细胞,而Del型低于200个/红细胞[11],常规血清学检测不出,需要通过吸收放散技术才能检测到。由于吸收放散方法略繁琐,操作不当易产生错误结果;且血清学方法不能明确分子机制,因此本次试验中,直接采用基因检测手段。本次发现的23例亚洲型DEL中,19例为Cc表型,4例为CC表型,均含有RhC抗原。在含有RhC抗原的全部44例个体中(37例Ccee,5例CCee,2 CcEe),52.3%(23/44)的RhC阳性者为亚洲型DEL,与之前报导类似[12-13],进一步提示RhC抗原可以作为亚洲型DEL的初判标志。

本次研究中,有11例产生了Rh系统抗体,其中10例为抗D,1例为抗DC,未进一步明确该抗体是否为联合抗DC,即抗G。11例个体中,除1名妊娠史不明确外,其余均为多次妊娠者,此外2号曾有输血史;在多次检测者中,发现随着孕期增加,抗体由阴转阳或效价有增高趋势,提示妊娠或输血等免疫史与同种抗D的产生及效价高低呈正相关,RhD阴性孕妇应尽可能避免多次免疫,以防止产生抗D抗体。

产生抗体的11例个体中,有9例为RHD*01N.01,1例为RHD*01N.03,1例为RHD*06.03.01。值得注意的是,23例亚洲型DEL,无一例产生抗D;其余几种基因类型,是否会产生同种免疫性抗D,需增大样本量进一步观察。郭伟等[14]在304名Rh阴性孕产妇中发现29例产生RhD抗体,无一例为亚洲DEL;Wang M等[15]在142名Del表型孕妇中,发现130例为亚洲型DEL,均未产生抗D;剩余的12例中,有6例产生抗体,其基因型为RHD与RHCE外显子发生不同程度的重组交换。亚洲型DEL血型的基因背景为exon9 3' 端最后1位碱基发生c.1227G>A同义突变,可能影响mRNA的正常拼接或拼接效率,导致RHD基因产物表达程度降低。因此,邵超鹏等[16]认为,亚洲型DEL孕妇妊娠RhD阳性胎儿发生抗D同种免疫反应的可能性很小,这部分个体可免去产前定期抗D筛查及预防性RhD免疫球蛋白的使用。本文的研究结果进一步支持此观点,该理论如果获得推广应用无疑有良好的社会效益。

致谢感谢下列人员对本文血清学实验提供的帮助:郑凌,薛敏,刘太香,冯晨晨,邵雷,张若洋

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

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