银慧慧，廖海洪，赵武，曾雪颜，童艳梅，刘伟*，姜源明，覃振华

（1.广西壮族自治区兽医研究所，广西兽医生物技术重点实验室，广西 南宁 530001；2.广西壮族自治区畜牧研究所，广西 南宁 530001；3.广西大学动物科学技术学院，广西 南宁 530005）

三萜类化合物（triterpenoids）[1-3]，又叫灵芝酸，是结构多样的有机化合物，具有多种生理功能。三萜的基本骨架主要由6个异戊二烯单位组成，可形成20 000多种天然的三萜类化合物，以四环三萜和五环三萜两大类为主[4-5]。三萜类化合物在自然界中分布广泛，是中草药中的有效成分，具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降血糖、降血脂、杀软体动物等生理活性。在天然植物中发现的熊果酸、齐墩果酸、白桦酯酸、羽扇豆醇、扁塑藤素和雷公藤红素等三萜类化合物，已被研究发现具有显著的抗肿瘤和抗炎等特性[6-8]。

桃金娘[Rhodomyrtus tomentosa（Ation）Hassk]，又名当泥、山稔、岗稔等，是一种优良的野生植物资源，广泛分布于东南亚国家[9-10]。桃金娘全株可入药，含有黄酮类、鞣质类、挥发油类、多糖类、萜类等多种成分，其不同部位的药用价值已被越来越多的学者研究[11-13]。其果实含有丰富的黄酮类、酚类、多糖类和其他活性成分[14]；根有祛风活络、收敛止泻的功效[15-16]；叶提取物具有收敛止泻，止血的功效，可用于缓解急性胃肠炎、消化不良、痢疾等病症[17-18]。现有对桃金娘叶中三萜成分的研究主要集中在三萜类化合物的结构等方面，已从桃金娘叶中分离出24个三萜类化合物主要为五环三萜皂苷元，五环三萜皂苷元的基本骨架可分为熊果酸、齐墩果酸、羽扇豆醇3种类型[19-21]。而桃金娘叶三萜提取及其抗氧化性研究未见报道。本研究以桃金娘叶为研究对象，采用超声辅助提取法对桃金娘叶进行提取，采用单因素试验和响应面法优化桃金娘叶三萜的超声辅助提取工艺，并探讨其抗氧化性，为桃金娘进一步的研究开发和综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桃金娘叶：采摘于广西玉林，经广西兽医研究所孙建华研究员鉴定为桃金娘植物叶，在65℃下烘干，粉碎后过40目筛，备用；熊果酸对照品（含量99.3%）：中国食品药品检定研究所；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、L-抗坏血酸（VC）：美国 Sigma-Aldrich 公司；甲醇、高氯酸、香草醛、冰醋酸（均为分析纯）：成都科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

TECAN model Infinite M200酶标仪：瑞士帝肯公司；HH-S4型恒温水浴锅：江苏金怡仪器科技有限公司；SK7200HP型超声波清洗器：上海科导超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水仪：密理博中国有限公司；F160型粉碎机：北京中兴伟业仪器有限公司；CAP225D型（精度0.1 mg）电子天平：德国赛多利斯集团。

1.3 试验方法

1.3.1 三萜提取工艺

桃金娘叶→烘干至恒重→粉碎→过筛→桃金娘叶粉末→提取溶剂→超声辅助提取→离心→上清液定容→三萜测定

1.3.2 三萜含量测定

以熊果酸为标准品，采用香草醛-高氯酸法[22]在酶标仪下测定三萜含量。标准曲线的制作：准确称取5mg熊果酸对照品，用甲醇溶解，配制熊果酸标准溶液浓度为 106.4 μg/mL。分别吸取标准溶液 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于6只带塞试管中，80℃水浴蒸干，每管依次加入5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，迅速摇匀后于70℃水浴15 min。结束后立即冷却，加入冰乙酸5 mL，摇匀，分别吸取200 μL置于96孔板中，在545 nm处测定吸光度。以熊果酸浓度C（μg/mL）为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为y=0.082 7x+0.031，R2=0.998 2。

准确称取1 g桃金娘叶细粉置于100 mL具塞锥形瓶内，按一定液料比加入提取溶剂，在一定的超声功率和一定的超声时间条件下超声（53 kHz，30℃）提取，离心过滤，收集上清液，取相应提取溶剂定容于50 mL棕色容量瓶中，充分摇匀后按标准曲线方法测定其吸光度并计算三萜含量。

式中：W为三萜含量，mg/g；C为样品溶液三萜浓度，μg/mL；V为样品提取液体积，mL；m为桃金娘粉末质量，g。

1.3.3 单因素试验

在1.3.2的提取方法下，以三萜含量为指标，分别考察提取溶剂（60%乙醇、95%乙醇、100%甲醇、60%甲醇、乙酸乙酯）、液料比[10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL/g）]、超声时间（15、30、45、60、75、90 min）、超声功率（262、280、298、316、334W）对提取桃金娘叶三萜含量的影响。

1.3.4 桃金娘叶三萜提取工艺优化

根据提取工艺的单因素试验结果，采用Design Expert 8.0.6的Box-Behnken中心组合试验设计原理[23]，以三萜含量为响应值，选择A液料比、B超声功率、C超声时间为影响因素设计响应面试验，对桃金娘叶三萜提取工艺条件进行分析和优化，试验因素水平见表1。

表1 因素水平设计Table 1 Factor level design

1.3.5 桃金娘叶三萜DPPH自由基清除能力研究

称取4 mg DPPH固体试剂，甲醇溶解并定容至100 mL，配制成40 μg/mL的DPPH溶液，避光保存备用。精密称取5 mg VC置于不同棕色容量瓶中，经甲醇溶解并定容至100 mL，稀释配制成浓度为29.00 μg/mL的阳性对照溶液。准确吸取不同体积最优条件的提取溶液于96微孔板中，再加入100 μL DPPH溶液，轻轻混匀后用甲醇补足体积至200 μL，避光反应30 min，在545 nm下测定吸光度，吸光度为As；空白组以等体积的甲醇代替DPPH溶液，其吸光度为Ab，对照组以等体积的甲醇代替提取溶液，吸光度为Ac。清除率按下式计算。

1.4 数据处理

每组试验处理设置3个重复，结果用平均值±标准差表示，采用Excel 2016和Design expert 8.0.6软件对试验数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取溶剂对桃金娘叶三萜含量的影响

固定液料比 30∶1（mL/g），加入不同提取溶剂，考察不同提取溶剂对三萜含量的影响，结果见图1。

图1 不同提取溶剂对桃金娘叶三萜含量的影响Fig.1 Effect of different solvent on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由图1可知，乙酸乙酯作为提取溶剂时，三萜含量最大。因此选择乙酸乙酯进行下一步提取研究。

2.1.2 液料比对桃金娘叶三萜含量的影响

固定提取溶剂为乙酸乙酯，考察不同液料比对三萜含量的影响，结果见图2。

图2 液料比对桃金娘叶三萜含量的影响Fig.2 Effect of liquid material ratio on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由图2可知，当溶剂体积逐渐增大时，加大了提取溶剂对物料的接触，降低了液料间的黏稠度，有利于超声波的空化效应，使得桃金娘叶三萜的含量逐渐增高；当液料比超过40∶1（mL/g）时，三萜含量呈现下降趋势，可能是由于提取溶剂达到一定用量后，三萜已经基本提取完全，此时继续增加提取溶剂的量，不仅使单位提取液中三萜浓度降低，并且加大了试剂的消耗，因此综合考虑，选择液料比40∶1（mL/g）进行提取。

2.1.3 超声功率对桃金娘叶三萜含量的影响

不同超声功率对三萜含量的影响见图3。

图3 超声功率对桃金娘叶三萜含量的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由图3可知，随着超声功率的增加，三萜含量不断增加，当超声功率为298 W时，三萜含量达到最大值，继续增加超声功率时，含量下降。这是由于超声功率的增加，超声作用加强，空化泡的运动越强烈，而随着超声功率的进一步增加，加速了提取溶剂的流动，从而影响三萜物质的溶出，此外，功率越大，产生的热效应也可能会破坏三萜的结构，使得三萜含量下降。故超声功率选择298 W进行下一步试验。

2.1.4 超声时间对桃金娘叶三萜含量的影响

不同超声时间对三萜含量的影响见图4。

图4 超声时间对桃金娘叶三萜含量的影响Fig.4 Effect of ultrasonic time on the content of triterpenoids from R.tomentosa leaves

由图4可知，随着超声时间的延长，三萜含量逐渐增高，当超声时间超过75 min，含量增加不明显，可能是超声时间的延长，热效应的增加、杂质的溶出增加，从而影响了三萜的提取效果。因此，综合考虑选择75 min为单因素试验的最优超声时间。

2.2 响应面法优化试验结果

2.2.1 建立模型

在单因素试验结果的基础上，根据Box-Behnken组合设计原理，以三萜含量为响应值（Y），利用Design Expert 8.0.6软件设计响应面试验，对三萜的提取条件进行优化，共进行17个试验点，其中包含12个析因点和5个零点试验，12个析因点试验用以考察液料比、超声功率、超声时间3个因素对三萜含量的影响是否显著，5次零点试验用作误差估计[24-25]。试验设计和结果见表2。

表2 响应面试验设计方案与结果Table 2 Test design and results of response surface methodology

2.2.2 方差分析与显著性检验

利用软件对试验结果进行二次多项式回归拟合，对表2的数据进行方差分析后得到模型的二次多项式回归方程为Y=13.68+0.56A-0.66B+0.28C-0.12AB+0.53AC-0.21BC+0.74A2-2.38B2+0.62C2。响应面多元二次模型方差分析结果见表3。

表3 响应面二次模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

由方差分析可知，模型的P＜0.000 1，表明试验所采用的二次模型显著，具有统计学意义。失拟项P值为0.240 1＞0.05，差异不显著，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

从表3可看出，一次项中，A液料比对三萜含量的线性效应呈现极显著（P＜0.01），B超声功率对三萜含量的影响差异极显著（P＜0.01），C超声时间对三萜含量的线性效应不显著（P＞0.05），二次项中，B2影响高度显著（P＜0.001），A2、C2影响极显著（P＜0.01），交互项中AC 影响显著（P＜0.05），AB、BC 影响不显著（P＞0.05）。此模型校正模型的相关系数R2值为0.974 6，决定系数R2Adj值为0.941 9，说明选用的模型与实际情况拟合较好、误差小，能较好反映出各因素与桃金娘叶三萜含量之间关系。由F值可知，在试验范围内各因素对三萜含量的影响大小依次为B（超声功率）＞A（液料比）＞C（超声时间）。

2.2.3 交互项对桃金娘叶三萜含量的影响

对A液料比、B超声功率、C超声时间3个因素进行两两交互作用分析，对其作响应面图和相应等高线图，结果见图5。

图5 响应面法立体分析图和相应等高线图Fig.5 Response surface graph and corresponding contour graph

图5能够直观地反映各因素交互作用对桃金娘叶三萜含量响应值的影响，由图5可以看出，随着液料比的增加，三萜含量呈现升高趋势，而超声功率的增大，含量先升高后降低；三萜含量随着液料比和超声时间的增加而增加；随着超声功率的增加，三萜含量先升高后降低，随着超声时间的增加含量升高。A液料比和C超声时间的响应面的极高值出现在等高线的内部，说明A与C的交互作用对响应值的影响是显著的，A和B、B和C对三萜含量的影响均不显著，这与方差分析结果一致。

2.2.4 最佳工艺与验证

通过最优结果分析，最佳的提取条件为液料比为 50∶1（mL/g），超声功率 294.26 W，超声时间 90 min，预测含量为16.54 mg/g。考虑在实际操作上的方便性，将各因素修正为液料比50∶1（mL/g）、超声功率294 W，超声时间90 min。在此条件下，对桃金娘叶三萜进行3次平行提取，含量为15.72 mg/g，与预测值基本相符。说明此模型能够很好地模拟桃金娘三萜提取的实际情况，模型有效。

2.3 超声辅助提取桃金娘叶三萜与其他方法的比较

本研究同时还采用了传统溶剂浸提法和水浴提取法对桃金娘叶三萜进行提取，得到的试验结果如表4所示。

由表4可知，超声辅助提取得到的三萜含量明显优于传统浸提法和水浴提取法。

2.4 桃金娘叶三萜DPPH自由基清除能力测定

超声辅助提取的桃金娘叶三萜样品DPPH自由基清除能力如图6所示。

图6 DPPH自由基清除能力Fig.6 Result of DPPH free radical scavenging activity

提取的三萜样品对DPPH自由基的清除效果明显，在浓度 0.77 μg/mL 至 12.27 μg/mL 范围内，随着浓度的增加其自由基清除率逐步递增。与阳性对照VC相比较，三萜样品在较低浓度下时对DPPH自由基清除能力低于VC，而随着三萜样品浓度的增加，其清除能力逐渐趋近于VC。桃金娘叶三萜样品和VC对DPPH自由基的 IC50分别为 1.284 μg/mL 和 0.639 μg/mL。

3 结论

由单因素试验确定了桃金娘叶三萜提取溶剂为乙酸乙酯，并通过响应面试验研究液料比、超声功率、超声时间3个因素对三萜含量的影响。结果表明，在试验范围内各因素对三萜含量的影响大小依次为超声功率＞液料比＞超声时间，液料比和超声功率对三萜含量的影响较大。三萜最佳提取工艺条件为液料比50∶1（mL/g）、超声功率 294 W，超声时间 90 min。在最优的提取条件下，桃金娘叶三萜的平均含量为15.72mg/g，优于传统浸提法和水浴提取法。在桃金娘叶三萜浓度为12.27μg/mL时，对DPPH自由基的清除率达92.52%，清除能力逐渐趋近于VC，说明该方法提取的三萜类物质具有较好的抗氧化性，可用于桃金娘叶中三萜的提取。