张旭 魏华华 王伟 石俊青 张艺凡

(1.成都市中西医结合医院·成都市第一人民医院呼吸内科二病区，四川 成都 610041；2.成都市第三人民医院呼吸内科，四川 成都 610000)

肺癌是临床常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率均居全球首位。据统计，肺癌患者中约有80%以上为非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)，早期 NSCLC患者手术治疗后5年总生存率可达86%，然而，肺癌早期确诊较为困难，大部分NSCLC患者确诊时已为晚期阶段，5年生存率甚至低于10%[1-2]。通过支气管镜或胸腔穿刺术活检等是目前 NSCLC诊断最可靠方法，然而这些操作不适用疾病普查，更不适合连续监测。因此，探索新的NSCLC诊断标志物对提高患者生存期具有重要价值。外泌体是细胞分泌的微小囊泡，具有脂质双层膜结构。外泌体可在血液、汗液、胸水、腹水、尿液等多种体液中检测到，可反映细胞生理病理状态[3]。微小RNA(micro RNA，miRNA)是近年来发现的内源性非编码小分子 RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡，外泌体可介导 miRNA转运[4]。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)是长度超过200个核苷酸的非编码RNA，在基因调控、监测细胞周期、细胞迁移中均具有重要作用[5]。本研究通过分析非小细胞肺癌血清外泌体miR-152-5p和lncRNA AGAP2-AS1水平，探讨其在在NSCLC早期诊断及预后评估中的价值，旨在为临床疾病的诊断与治疗提供参考，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取成都市第一人民医院2014年6月～2016年12月收治的120例NSCLC患者临床资料(NSCLC组)，另选择60例同期于本院进行健康体检的人群作为对照组。纳入标准：①临床组织学或细胞学检查确诊为NSCLC。②影像学检测证实。③可接受随访。④经医院伦理委员会批准，患者及家属知情同意。排除标准：①合并其他部位或其他肿瘤类型。②合并血液、骨髓、免疫性疾病。③合并心脑血管疾病。④合并严重感染。⑤近3个月内接受过放化疗或外科手术治疗。

1.2 方法 NSCLC患者与疾病初次诊断时，健康体检者于体检当日采集空腹静脉血，均于采集24 h内予以离心处理，取上层血清，保存于-80℃条件下待检，注意避免溶血。

1.2.1 血清外泌体的提取与鉴定 溶解冷冻血清，4℃条件下以3000 r/min离心15 min，去除沉淀以及脂质层。取500 μL至EP管，加入SBI沉淀剂120 μL，颠倒混匀，于4℃～8℃低温条件下静置30 min，13000 r/min高速离心2 min，弃上清，留沉淀，使用200 μL吸头铺开沉淀于管壁。

1.2.2 RT-PCR定量检测血清外泌体中RNA 往沉淀中加入700 μL QIAZOL Lysis Reagent，搅拌至沉淀溶解，加入100 μL氯仿，剧烈振荡15 s，室温条件下静置2 min。4℃条件下以12000 r/min离心15 min，调至室温。取上层水相350 μL转移至EP管，加入525 μL无水乙醇，混匀，取700 μL 样品加入RNeasy Mini Spin Column，12000 r/min离心30 s，弃流出液，若液体残留则重复离心处理。向柱子中加入700 μL Buffer RWT，12 000 r/min离心30 s，弃流出液。向柱子中加500 μL Buffer RPE，12000 r/min离心30 s，弃流出液，重复1次，空转1 min，滤膜干燥。将柱子转移至EP管中，加入35 μL RNeasy -free water，12000 r/min离心1 min，RNA洗脱，使用Nano-Drop 2 000检测RNA的浓度。按照说明书将RNA逆转录为cDNA，通过RT-PCR检测miR-152-5p和lncRNA AGAP2-AS1相对表达量。以U6作为内参进行相对定量，U6引物序列为5′-TTATGGGTCCTAGCCTG ACCACTATTGCGGCtGCTGC-3′，miR-152引物序列:5′-GATGAGGAGTGTCGTGGAGTCGGCAAT TTCCTCATCAAGTCGGAG -3′。lncRNA AGAP2-AS1引物序列为5′-TAGAGCAAGTGATGACAAC AGGCAGGTAACAATGGAGAA-3′，△Ct= CtAGAP2-AS1-CtU6。采用2-△△Ct法计算两者的相对表达量，△Ct=CtmiR-152-CtU6。

2 结果

2.1 两组一般资料比较 NSCLC组包括男性66例，女性54例；年龄41～78岁，平均(65.59±5.40)岁；吸烟史：有57例，无63例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期75例，Ⅲ～Ⅳ期45例；局部浸润程度：T1～T2共78例，T3～T4共42例；淋巴结转移：无67例，有53例。对照组包括男性32例，女性28例；年龄40～77岁，平均(65.94±5.97)岁；吸烟史：有27例，无33例。两组性别、年龄、吸烟史比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 两组miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表达水平比较 NSCLC组患者miR-152-5p表达水平低于对照组，lncRNA AGAP2-AS1表达水平高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 NSCLC组与对照组miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表达水平比较

2.3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1诊断NSCLC价值分析 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1联合检测诊断NSCLC的发生ROC曲线下面积高于单独检测ROC曲线下面积(P<0.05)，见表2、图1。

表2 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1诊断NSCLC价值分析

图1 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平诊断NSCLC疾病ROC曲线

2.4 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1与NSCLC临床病理特征的关系 不同性别、年龄NSCLC患者miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)；临床分期Ⅲ～Ⅳ期、局部浸润T3/T4、淋巴结转移患者miR-152-5p表达低于Ⅰ～Ⅱ期、局部浸润T1～T2、无淋巴结转移患者，lncRNA AGAP2-AS1表达高于Ⅰ～Ⅱ期、局部浸润T1～T2、无淋巴结转移患者(P<0.05)，见表3。

表3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1与NSCLC临床病理特征的关系分析

2.5 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1在NSCLC病理分期中的应用价值 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1联合检测判断NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期ROC曲线下面积高于单独检测ROC曲线下面积(P<0.05)，见表4、图2。

表4 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1评估NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期价值分析

图2 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1评估NSCLC患者Ⅰ/Ⅱ期与Ⅲ/Ⅳ期ROC曲线

2.6 NSCLC生存与死亡患者 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表达水平比较 随访3年，120例NSCLC患者中共有5例失访，其余115例患者中生存组患者66例，死亡组患者49例，生存组miR-152-5p表达量高于死亡组，lncRNA AGAP2-AS1表达量低于死亡组(P<0.05)，见表5。

表5 生存与死亡组miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1表达水平比较

2.7 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平预测NSCLC患者预后价值分析 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1联合检测判断NSCLC预后ROC曲线下面积为0.849高于单独检测ROC曲线下面积0.739、0.714(P<0.05)，见表6、图3。

图3 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平预测NSCLC患者预后ROC曲线

表6 miR-152-5p、lncRNA AGAP2-AS1水平预测NSCLC患者预后价值分析

3 讨论

外泌体广泛存在于多种人体体液，其含有多种生物活性分子如mRNA 、miRNA 、lncRNA 、蛋白质、脂质等[6-7]。外泌体因能反映来源细胞病理状态，被认为是极具潜力的新型诊断标志物，被应用于多种类型疾病的诊断及治疗[7]。miRNA是长度约为22 个核苷酸的内源性、短单链非编码RNA 分子，与肿瘤的发生与进展、细胞分化、细胞凋亡、细胞信号传导等密切相关，在真核生物基因转录后的调控中具有关键性作用[4,8]。汪毅等[9]研究结果显示miR-152在消化系统以及生殖系统肿瘤的细胞与组织中表达水平下降，对肿瘤细胞生长、增殖等重要的生物学功能，具有抑癌基因作用。本研究发现miR-152在NSCLC患者血清外泌体中同样为低表达状态，miR-152 在NSCLC诊断中ROC曲线面积为0.813，诊断效能较高。本研究对NSCLC临床病理分期与 miR-152-5p 相对表达量的关系进行分析发现miR-152-5p相对表达量与患者年龄、性别无关，与TNM分期、局部浸润程度、淋巴结转移有关。以上研究结果说明血清外泌体中miR-152-5p可能成为NSCLC早期诊断的特异生物标志物。郑清月等[10]研究结果显示miR-152通过作用于神经蛋白-1 和AD-AM17来抑制NSCLC进展，miR-152的表达和肺腺癌患者生存期正相关。本研究分析miR-152表达在患者预后中的评估价值结果显示ROC曲线下面积为0.739。

lncRNAs的表达改变是肿瘤发生驱动因素之一，其在不同阶段均参与基因表达调控。作为信号分子，lncRNAs可和蛋白质相互结合，形成复合物与启动子结合，调节下游基因转录过程；lncRNAs可作为引导员，指引蛋白靶向运动到相应启动子位点；此外作为诱饵，lncRNAs可阻止调控蛋白与启动子位点结合[11-12]。越来越多的研究显示异常lncRNA 表达在肿瘤发展过程中具有关键作用[13-15]。AGAP2-AS1是一种反义lncRNA，转录位点12q14.1，1567个核苷酸长度。Zheng等[16]研究结果显示AGAP2-AS1在人类NSCLC中过表达。本研究中NSCLC组患者血清外泌体中AGAP2-AS1表达水平高于健康对照组，与上述研究结果一致。AGAP2-AS1在NSCLC诊断中ROC曲线面积为0.808，提示血清外泌体 AGAP2-AS1诊断 NSCLC 的诊断效能较高。王凯等[17]研究结果显示AGAP2-AS1在人肾细胞癌组织和细胞中高度表达，其表达量与患者不良预后有关，且沉默AGAP2-AS1可抑制肾细胞癌细胞增殖、迁移，提示AGAP2-AS1可能在肾细胞癌发生和进展中的作用。本研究中不同临床病理分期、不同淋巴结转移状态NSCLC患者AGAP2-AS1表达水平具有明显差异。Nakken等[18]研究结果显示肺癌患者AGAP2-AS1与其临床病理分期呈现负相关。Su等[19]研究则表明肺癌患者临床病理为Ⅲ～Ⅳ期的患者miR-152-5p水平高于Ⅰ～Ⅱ期患者，同时miR-152-5p、AGAP2-AS1二者联合检测对Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期肿瘤分期的鉴别价值高达0.902，具有较高的应用价值。Messemaker等[20]研究中分析200例NSCLC患者中AGAP2-AS1高表达与低表达患者3年生存率，结果显示AGAP2-AS1高表达患者3年生存率高于低表达患者。本研究中AGAP2-AS1表达在患者不良预后中的评估价值，ROC曲线下面积为0.714，miR-152-5p预后预测曲线下面积为0.739，表明NSCLC患者AGAP2-AS1、miR-152-5p水平可反映患者预后，作为判断NSCLC生存和预后指标。

4 结论

NSCLC患者血清外泌体miR-152-5p呈现低表达，lncRNA AGAP2-AS1呈现高表达，二者表达水平与NSCLC临床分期、肿瘤浸润、淋巴结转移有关，在患者疾病诊断与预后评估中具有重要价值。