吴筱蔓 周兴星 顾翔 喻慧岭 潘晓玲 周敏

(华中科技大学附属武汉中心医院，湖北 武汉 430000)

喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，近年来，随着饮食习惯的改变，我国喉癌发病率及死亡率呈明显增高趋势，严重威胁患者的健康与生命。有学者报道，微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associatedprotein1 lightchain3，LC3)是编码自噬相关蛋白的重要基因，与肿瘤的发生有着密切关系[1]。基质金属蛋白酶(Recombinant Matrix Metalloproteinase，MMPs)可降解血管基底膜及其他基质成分，加速肿瘤的侵袭，在肿瘤侵袭及转移中起着重要作用[2]。现有较多学者报道，程序性死亡因子1(Mouse Programmed Death 1，PD-1)具有负向调节T细胞活性的功能，在恶性肿瘤中呈高表达状态[3-5]。本研究拟通过免疫组织化学方法检测LC3、MMP-14及PD-1在喉癌及非喉癌组织中的表达情况，并分析上述三种蛋白与喉癌患者病理特征的关系，以探讨LC3、MMP-14及PD-1表达情况对患者预后的影响，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2016年7月～2018年7月于我院收治的36例喉癌患者的临床资料，所有患者均经手术或穿刺活检证实，共36份喉癌组织标本设为观察组。其中男性21例，女性15例；年龄45～78岁，平均年龄(55.59±3.57)岁；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期15例，Ⅲ～Ⅳ期21例；吸烟量>400(年×支/日)者20例，吸烟量≤400(年×支/日)者16例。纳入标准：①所有患者均经实验室、影像检查确诊为喉癌。②预测生存期在6个月以上者。③临床、影像资料完整。④均选取同一标本，分别检测LC3、MMP-14及PD-1水平。排除标准：①合并其他恶性肿瘤、器官衰竭等严重者。②肿瘤出现远处转移者。③术前已进行化疗或放疗治疗者。同时选取上述36例喉癌患者手术切除的正常组织标本作为对照组。本研究经医院伦理委员会审核批准。

1.2 方法

1.2.1 试剂 兔抗人多克隆抗体LC3、MMP-14及PD-1均由美国Santa Cruz公司提供，DNA显色剂由北京中杉金色桥生物技术公司提供，抗体免疫组织化学试剂盒由上海嵘葳达实业有限公司提供。

1.2.2 指标检测 采用免疫组化SP染色。将喉癌组织和正常组织标本经常规石蜡切片、脱水，加入100%、95%、85%梯度酒精各5 min，自来水冲洗。3%过氧化氢溶液-甲醇室温10 min，蒸馏水冲洗3 min，pH9.0EDTA缓冲液煮沸20 min抗原修复，加一抗(1∶70)室温放置2 h。用DNA显色剂显色，苏木精复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。显微镜下观察LC3、MMP-14及PD-1，检测严格按照说明书进行，检测完成后由2位高年资医师双盲法阅片。

1.2.3 判断标准 阳性判断标准：肿瘤细胞胞质或细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒。阳性细胞占比：0分(无阳性)、小于30.00%(1分)、大于等于30.00%(2分)。染色强度评分：0分(无色)、1分(淡黄色)、2分(棕黄色)、3分(棕褐色)；阳性细胞所占百分比小于26%为1分，阳性细胞所占百分比26%～50%为2分，阳性细胞所占百分比51%～75%为3分，阳性细胞壁大于75%为4分。根据两者相乘结果进行评判：小于3分(-)、3分(+)、4分(++)、5分(+++)。阳性率=阳性例数/总例数×100%。

2 结果

2.1 LC3、MMP-14及PD-1在不同组织中的表达 喉癌组织中的LC3、MMP-14及PD-1阳性表达率分别为36.11%、72.22%、58.33%；正常组织中的LC3、MMP-14及PD-1阳性表达率分别为72.22%、41.67%、8.33%；两者LC3、MMP-14及PD-1阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

表1 LC3、MMP-14及PD-1在不同组织中的表达[n(×10-2)]

图1 免疫组化染色(500×)

2.2 喉癌组织中LC3、MMP-14及PD-1表达与临床病理特征的关系 选取有意义的单因素进一步行多因素分析，LC3、MMP-14及PD-1表达情况与临床分期、淋巴结转移、分化程度有关(P<0.05)，见表2。

表2 喉癌组织中LC3、MMP-14及PD-1表达与临床病理特征的关系

2.3 36例喉癌患者两年生存率 本研究以门诊复查或电话随访的方式进行为期2年的随访，截止于2020年7月，36例喉癌患者共死亡10例，存活26例，存活率为72.22%。

2.4 LC3、MMP-14及PD-1表达与喉癌预后的关系 LC3表达阴性及表达阳性中位生存期分别为(28.65±2.49)个月、(32.92±1.99)个月，MMP-14表达阴性及表达阳性中位生存期分别为(30.46±1.48)个月、(24.48±1.79)个月，PD-1表达阴性及表达阳性中位生存期分别为(25.71±2.04)个月、(19.40±1.63)个月。生存分析显示LC3表达阳性者生存期较长，MMP-14及PD-1表达阴性者生存期较长，Keplan-meier生存曲线明显不同(P<0.05)，见图2～4。

图2 LC3阳性表达与LC3阴性表达期比较

2.5 影响喉癌患者预后生存的单因素和多因素分析 年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、吸烟史非影响喉癌患者预后生存的相关危险因素(P>0.05)，临床分期(Ⅲ～Ⅵ期)、有淋巴结转移、高分化、LC3表达阳性、MMP-14表达阳性及PD-1表达阳性为影响喉癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.05)，见表3。

图3 MMP-14阳性表达与MMP-14阴性表达期比较

图4 PD-1阳性表达与PD-1阴性表达期比较

表3 影响喉癌患者预后生存的单因素和多因素分析

3 讨论

喉癌发病机制至今尚未阐明，较多学者研究认为，喉癌的发生可能与空气污染、烟酒过度、职业性接触致癌物等因素有关[6-8]。随着分子水平的发展，特别是癌基因对肿瘤发生、发展的相关机制研究成为临床医师关注的热点。近年来，有不少学者报道，生物学指标对喉癌的诊断及预后评价有重要意义[9-11]。

自噬是真核细胞降解蛋白的重要途径，有助于细胞成分和细胞器的正常更新[12]。相关研究指出，真核细胞中溶酶体依赖的内源性底物均会经过自噬等自我降解的过程，影响细胞清除废物、生长发育、重建结构等过程，并在这些过程中发挥作用[13]。LC3被鉴定是自噬溶酶体最基本的组成成分，其表达强度与自噬活性成正比，当LC3水平降低时，细胞自噬能力下降，细胞恶性增殖速度加快，而变异、损伤的细胞得不到有效及时的清除，则会发生癌变[14-15]。同时LC3缺失或下调，会激活多种癌基因，诱发癌细胞生长，促使喉部组织恶性病变，加重病情进展[16-18]。研究发现喉癌组织中LC3阳性表达率明显低于正常组织阳性表达率(P<0.05)，与韩冰等[19]研究结果相符。提示喉癌组织中存在LC3表达缺失或下调，会导致细胞自噬能力下降，恶性细胞快速增殖，导致喉癌发生。

既往文献资料报道，MMP-14是MMPs家族中主要的特殊蛋白酶，可直接降解、破坏肿瘤患者细胞外基质及基底膜，具有促进新生血管生成的作用[20-21]。MMP-14可以启动细胞表面多个蛋白级联反应，直接降解与破坏肿瘤患者的细胞外基质和基底膜，打破阻挡肿瘤细胞因子浸润的屏障。PD-1是负性共刺激信号之一，在淋巴细胞活化过程中，被诱导表达的一个免疫抑制性受体，与机体免疫反应有关[22]。既往研究报道MMP-14、PD-1在恶性肿瘤中阳性表达率明显增高[23]，与本研究结果结论一致。分析MMP-14、PD-1在喉癌组织中阳性表达率较高的原因是MMP-14可转录调节血管内皮生长因子水平，会促进喉癌细胞的血管生成，加重癌细胞侵袭[24]。PD-1与其配体结合后，诱导T细胞免疫耐受，可抑制肿瘤抗原特异性T细胞活化，给喉癌细胞提供了逃避机体免疫监控和杀伤的机会，促进了癌细胞增殖、转移[25]。由此可见，二者对肿瘤的侵袭、转移均发挥了重要作用。

临床分期及淋巴结转移为临床公认的判断喉癌侵袭程度与预后的关键性指标。本研究中高分化喉癌组织LC3阴性表达率更低，MMP-14及PD-1阳性表达更高，也表达肿瘤分化程度与LC3、MMP-14及PD-1表达密切相关，这一结论与文献报道相符[26]。已有相关文献证实MMP-14、PD-1在乳腺癌、胃癌等恶性肿瘤中的表达与患者预后不良密切相关[27]。本研究结果表明，LC3、MMP-14及PD-1的表达与临床分期、淋巴结转移、分化程度有关(P<0.05)。

生存分析显示，LC3表达阴性、MMP及PD-1表达阳性者2年内平均生存时间明显短于与LC3表达阳性、MMP-14及PD-1表达阴性者(P<0.05)，提示LC3、MMP-14及PD-1与喉癌患者预后存在密切联系。亦说明LC3的缺少或下调影响细胞凋亡过程，增加了细胞突变的几率，大幅提高了喉癌的发生率；MMP-14及PD-1高表达肿瘤的侵袭力，促进了肿瘤的发生、发展[28]。但本研究仍存在不足，可能导致研究结果存在偏倚，今后我们将改善相关研究方法，进一步扩大样本范围，以降低实验误差，并对LC3、MMP-14及PD-1的作用机制进行深入研究。

4 结论

LC3阴性表达及MMP-14、PD-1阳性表达会增加喉癌患者死亡率，影响喉癌患者预后生存率。LC3、MMP-14、PD-1可作为判断喉癌患者肿瘤进展及预后的标志物，对评估患者预后具有重要意义。