李超 李敬风 雷尚斌 顾坚 陈霞 唐宋琪

(1.湖北省十堰市太和医院儿童医疗中心3病区，湖北 十堰 442000；2.海南医学院，海南 海口 571100)

过敏性哮喘是一种临床常见的慢性炎症性疾病，近年来，哮喘在儿童中的发病率逐年增加，对儿童的生活和学习带来严重影响[1-2]。目前，临床治疗儿童过敏性哮喘多采用传统西医疗法，虽然可以在一定程度上缓解患儿的病情和症状，但同时伴随着较多不良反应，复发率较高[3]。鱼藤素是一种天然异黄酮化合物，可从三叶鱼藤等豆科藤本植物中提取分离，能够抑制癌细胞增殖、侵袭和迁移，具有较强的细胞选择性和高效低毒的特点[4-5]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路与哮喘的发生发展密切相关，抑制NF-κB/MAPK信号通路可改善哮喘小鼠的过敏性气道炎症反应[6]。研究证明，鱼藤素可通过下调NF-κB信号通路产生抗炎活性，从而减轻卵清蛋白(ovalbumin，OVA)诱导的小鼠哮喘[7]。虽已有研究证明鱼藤素具有确切的抗肿瘤作用和一定的抗哮喘作用，但其在儿童过敏性哮喘中的作用研究尚少，其作用机制尚不清楚。因此，本研究通过OVA致敏和激发在幼鼠中建立过敏性哮喘模型，观察鱼藤素对幼鼠过敏性哮喘的抑制作用，并初步探究其作用机制。

1 实验与方法

1.1 实验动物 BALB/c小鼠50只，雌雄各半，4周龄，体质量(14.5±0.2)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验动物及饲养条件符合《实验动物管理条件》要求。饲养条件：室温(22±2)℃，湿度(50±10)%，每天定时换气，保持12 h：12 h光暗照明，食水不限。本研究方案获医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂与仪器 鱼藤素(纯度>95%，Sigma-Aldrich，批号：R8875)，甲强龙(辉瑞公司，批号：AT8319)，IgE、IL-1β、IL-13 ELISA试剂盒(武汉伊莱瑞特生物科技有限公司，批号：E-EL-M3034，E-EL-M0037c，E-EL-M0727c)，p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK兔源单克隆抗体，羊抗兔二抗(美国CST公司，批号：8242，4812，8690，4370，4668，14708)，RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit(美国Thermo Scientific，批号：K1622)，蛋白定量试剂盒(博士德生物，批号：AR0146)，OVA、瑞氏-姬姆萨复合染液、HE染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司，批号：A8041，G1020，G1121)，压缩空气式雾化器(石家庄大桥医疗器械有限公司)，MET VX200-T型涡旋振荡器[施锐(上海)贸易有限公司]，DW-86L626超低温冰箱(海尔集团)，DYCZ-24KS型双板垂直电泳仪(北京六一仪器厂)，IX53显微镜(日本奥林巴斯)，G:BOX多功能凝胶成像系统(Syngene)，Multiskan MK3酶标仪(Thermo Fisher Scientific)，TGL16MB高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 分组与造模 将50只BALB/c小鼠随机分为正常组、模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组，每组各10只。除正常组外，其余各组小鼠均建立过敏性哮喘模型。造模方法：分别在第1天和第14天对小鼠腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(1 mg氢氧化铝和0.4 mg OVA溶于PBS缓冲液中)进行致敏，在第21～23天时将小鼠置于雾化器内，进行1% OVA溶液雾化吸入激发，每次30 min，每天1次，连续3 d。若小鼠出现呼吸频率升高、口唇发绀、点头呼吸和站立不稳等现象则表明造模成功，正常组采用PBS代替OVA致敏液进行致敏和雾化激发[8]。造模期间观察显示，模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠均成功建立过敏性哮喘模型。

1.3.2 给药方法 造模第21天开始给药。雾化前1 h，鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠腹腔分别注射4 mg/kg、2 mg/kg 鱼藤素溶液(用DMSO溶解后采用生理盐水稀释至DMSO浓度小于0.1%)，甲强龙组小鼠腹腔注射1 mg/kg甲强龙溶液，正常组和模型组小鼠腹腔注射等量生理盐水，每天1次，连续3 d(造模第21～23天)。

1.3.3 血浆和支气管肺泡灌洗液(BALF)收集 末次OVA雾化激发24 h后，各组小鼠摘眼球取血，与枸橼酸钠溶液混合均匀(血液与枸橼酸钠溶液的比例为9∶1)，4℃环境下3 000 r/min离心10 min，离心半径为12.5 cm，收集上层血浆，分装在EP管中，置于-80℃冰箱中保存。取血完成后，打开小鼠颈部，分离气管，在气管上做一T形切口，插入静脉留置针，用PBS缓冲液冲洗3次，收集BALF，2500 r/min离心10 min，离心半径为12.5 cm，分别保存上清和沉淀备用。

1.3.4 ELISA试剂盒检测血浆总IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平 取各组待测血浆和BALF上清加入到反应孔中，每孔100 μL，每组分别设4个复孔， 37℃孵育90 min，弃掉孔内液体，加入100 μL生物素化抗体工作液，37℃孵育60 min，弃掉孔内液体，洗涤3次，随后加入100 μL酶结合物工作液，37℃孵育30 min后弃掉孔内液体，洗涤5次，每孔加入90 μL底物溶液，37℃孵育15 min，加50 μL终止液，450 nm波长下检测，按照标准曲线计算各组大鼠血浆中总IgE和BALF中IL-1β、IL-13的含量。

1.3.5 BALF中炎性细胞分类计数 离心后的BALF沉淀用0.5 mL PBS缓冲液重悬，移液器吸取10 μL进行细胞计数，然后取50 μL细胞悬液涂片，自然干燥后滴加瑞氏-姬姆萨复合染液2～3滴使之覆盖到整个细胞涂片，染色1～2 min，然后滴加等量PBS缓冲液，轻轻晃动涂片，使之与瑞氏-吉姆萨染液混合均匀后再染色3～5 min，染色完毕后水洗，置于高倍镜下对细胞进行分类计数。

1.3.6 HE染色观察小鼠肺组织病理变化 取各组小鼠肺组织，置于4%多聚甲醛中固定48 h，蒸馏水清洗，然后置于不同浓度的酒精中进行梯度脱水，制作组织蜡块，冰上预冷切片，切片厚度为4 μm，二甲苯脱蜡30 min，在不同浓度梯度的乙醇溶液中复水，使用苏木精和伊红染液分别染细胞核和细胞质，脱水、透明后用中性树胶封片，置于显微镜下观察各组小鼠肺组织病理变化。

1.3.7 qRT-PCR检测小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA水平 称取0.1 g小鼠肺组织，冰上研磨，加1 mL Trizol裂解液提取组织总RNA，使用RevertAidTMfirst Strand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒合成cDNA，作为荧光定量模版。引物由日本Takara 公司设计合成，所有样品均以GAPDH为内参。反应体系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq 酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA 模板2 μL +上下游引物分别1 μL，加去离子水至总体积25 μL。反应条件为：95℃预变性 5 min，95℃变性 30 s、62℃退火 30 s、72℃延伸 30 s，共40个循环，最后72℃延伸10 min，4℃再延伸 5 min终止反应，实验重复3次。采用2-△△CT的方法计算目的基因mRNA相对表达水平。引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.3.8 Western blot检测肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平 称取各组小鼠肺组织0.1 g，剪碎后置于研磨器中冰上研磨，离心后取沉淀，沉淀中加入RIPA裂解液处理组织匀浆，提取组织蛋白，BCA法蛋白定量，确定蛋白浓度，随后配置15%的分离胶和5%的浓缩胶进行SDS-PAGE电泳，上样后80 V电泳2 h，60 V转膜2 h，5%脱脂奶粉封闭2 h，将条带放入10 mL p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK兔源一抗稀释液中(抗体稀释比例均为1∶1 000)，条带在一抗稀释液中4℃过夜，第2天用TBST缓冲液清洗3次，每次10 min，然后加入羊抗兔二抗(1∶1 000)，37℃孵育2 h，TBST缓冲液清洗3次后滴加ECL发光液，反应1 min后置于凝胶成像系统显影。免疫印迹实验的内参蛋白为GAPDH，用Image J软件分析各个蛋白对应的灰度值，计算蛋白的相对表达量，蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

2 结果

2.1 各组小鼠血浆总IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平比较 与正常组比较，模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平均降低(P<0.05)；与甲强龙组比较，鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平升高(P<0.05)，其中，鱼藤素高剂量组小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平低于鱼藤素低剂量组(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠血浆总IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平比较

2.2 各组小鼠BALF中炎性细胞数量比较 模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠BALF中炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量均高于正常组(P<0.05)；与模型组比较，甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量均减少(P<0.05)；鱼藤素高剂量组BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量与甲强龙组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，鱼藤素低剂量组BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量高于甲强龙组(P<0.05)；鱼藤素高剂量组BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量低于鱼藤素低剂量组(P<0.05)，见表3。

表3 各组小鼠BALF中炎性细胞数量比较

2.3 各组小鼠肺组织病理变化比较 HE染色结果显示，正常组小鼠肺组织中气道血管周围有少量炎性细胞存在；与正常组比较，模型组小鼠气道血管周围有大量的炎性细胞浸润，肺泡轮廓不清晰，肺泡壁增厚；与模型组比较，甲强龙组、鱼藤素高剂量组、鱼藤素低剂量组小鼠气道血管周围的炎症细胞浸润现象明显减轻，其中甲强龙组的炎症渗出减少最显著，鱼藤素高剂量组和低剂量组次之，与正常组比较，肺组织仍存在肺泡壁水肿、增厚和肺泡轮廓欠清晰现象，见图1。

图1 各组小鼠肺组织病理变化(400×)

2.4 各组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平比较 与正常组比较，模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平降低(P<0.05)；与甲强龙组比较，鱼藤素高剂量组和低剂量组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平升高(P<0.05)，其中，鱼藤素高剂量组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平低于鱼藤素低剂量组(P<0.05)，见表4。

表4 各组小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平比较

2.5 各组小鼠肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平比较 与正常组比较，模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组小鼠肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平均显著升高(P<0.05)；与模型组比较，甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平均降低(P<0.05)；与甲强龙组比较，鱼藤素高剂量组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，鱼藤素低剂量组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平升高(P<0.05)；与鱼藤素高剂量组比较，鱼藤素低剂量组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平升高(P<0.05)，见图2、表5。

图2 Western blot法检测肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达

表5 各组小鼠肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平比较

3 讨论

过敏性哮喘是一种以气道高反应性、气道炎症和可逆的气道阻塞为主要特征的慢性呼吸系统疾病[9]。流行病学研究显示，全球5%～16%的人口患有过敏性哮喘，其中儿童患过敏性哮喘的比例正在逐年上升，严重影响儿童的成长、学习和生活[10]。鱼藤素是一种从植物中提取的天然异黄酮化合物，具有较强的抗肿瘤活性，同时能够减轻小鼠过敏性哮喘气道炎症，但其在儿童过敏性哮喘中的作用尚不清楚[11-12]。本研究采用OVA致敏和激发在幼鼠中建立过敏性哮喘模型，观察鱼藤素对幼鼠过敏性哮喘的作用，探究其作用机制。

IgE是介导Ⅰ型变态反应的抗体，其升高与过敏性疾病的发生密切相关[13]。IL-1β和IL-13等炎性因子能够刺激中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等炎性细胞向气道聚集，增加气道黏液分泌和气道重塑[14-15]。本研究发现，OVA致敏和雾化吸入激发可使小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平显著升高。与模型组比较，高剂量和低剂量鱼藤素可使小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平降低，其中，鱼藤素高剂量组小鼠血浆IgE和BALF中IL-1β、IL-13水平低于鱼藤素低剂量组，略高于甲强龙组。qRT-PCR检测结果与上述结果一致，甲强龙、高剂量和低剂量鱼藤素均可使小鼠肺组织IL-1β和IL-13 mRNA表达水平降低，但与甲强龙组比较，鱼藤素高剂量组和低剂量组IL-1β和IL-13 mRNA表达增加，表明鱼藤素能够减轻哮喘小鼠过敏性和炎性反应。

炎症是过敏性哮喘的典型病理特点，过敏性哮喘的不同阶段均有中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞等炎症细胞在肺组织的浸润和聚集，此类细胞又可以分泌多种炎症细胞因子，对过敏性哮喘气道病变有重要作用[16-17]。本研究发现，模型组、甲强龙组、鱼藤素高剂量组和低剂量组小鼠BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量均高于正常组。与模型组比较，高剂量和低剂量鱼藤素均减少BALF炎性细胞总数、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数量，其中高剂量鱼藤素的作用与甲强龙组相当。HE染色结果显示，模型组小鼠气道血管周围有大量的炎性细胞浸润，肺泡轮廓不清晰，肺泡壁异常增厚，而甲强龙和鱼藤素可改善OVA所致的炎症细胞浸润和肺泡壁增厚水肿现象，其中甲强龙组的炎症渗出减少最显著，鱼藤素高剂量组和低剂量组次之，表明鱼藤素可减轻过敏性哮喘小鼠肺组织病理改变，抑制炎症细胞浸润。

NF-κB和MAPK信号通路在哮喘发生发展中发挥重要作用。研究表明，NF-κB信号通路在炎症和免疫反应中均存在大量的基因表达，当被细胞因子、活性氧等刺激后，可诱导IκB从p50和p65二聚体解离并发生磷酸化，从而促进过敏性哮喘中的炎症反应[18-19]。MAPK信号通路在多种疾病中普遍表达，几乎涉及到哮喘炎症网络的所有方面，是哮喘治疗的潜在靶标，抑制MAPK信号通路中的三种主要激酶ERK1/2、JNK和p38 MAPK的活化可显著改善哮喘炎症反应和气道重塑[20-22]。本研究结果显示，与模型组比较，甲强龙、高剂量和低剂量鱼藤素可使小鼠肺组织p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达降低，其中，鱼藤素高剂量组p-NF-κB p65、p-IκBα、p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白表达水平低于鱼藤素低剂量组，与甲强龙组蛋白表达水平相当，表明鱼藤素可抑制过敏性哮喘小鼠肺组织NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白的活化。

4 结论

鱼藤素能够减少哮喘小鼠血浆IgE，降低BALF和肺组织炎症因子IL-1β、IL-13表达，改善肺组织病变并抑制炎症细胞浸润，其作用机制与抑制NF-κB/MAPK信号通路相关蛋白的活化有关。