周蕊 张健 黄娜 陈海燕 谭婷 朱建宏 张爱军 杨军 李君 李宗芳

(西安交通大学第二附属医院 1.生物诊断治疗国家地方联合工程研究中心；2.干部病房普通外科，陕西 西安 710004)

重症急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis, SAP)并发症多，危及患者生命[1-4]。SAP中医病机为湿热蕴结、血瘀血热、腑实不通[5-6]。清胰汤是祖国传统医学治疗SAP的经典方剂，由大黄、柴胡、白芍、黄芩、黄连等多味中药组成，已被广泛应用于国内多家医院的临床实践[7-9]。应用清胰汤通里攻下，活血化瘀，在大量动物及临床实验均得到良好疗效[10-13]，可有效控制SAP时的全身炎症反应，减轻SAP对机体造成的损害，保护各脏器功能，降低死亡率[14-15]。本课题组前期依据中医及现代医学理论、中药配伍原则，对清胰汤进行了精炼，筛选出君药大黄及臣药黄芩的有效成分大黄素、黄芩素，首次提出复方大黄素黄芩素配方(已获国家发明专利，专利号：ZL200310105814.3)，并经实验证实对大鼠SAP有很好的治疗作用，且与生长抑素类似物善得定疗效相似[16]，同时对复方大黄素黄芩素中大黄素、黄芩素最佳组方配比进行了探讨[17]。但大黄素、黄芩素的交互作用(协同、相加、拮抗)及组方的合理性尚未可知。本研究采用拆方研究的方法，对此进行了研究，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 50i型正置显微镜(日本Nikon)，EG1150型石蜡包埋机(德国Leica)，RM2235型石蜡切片机(德国Leica)，HI1220型烤片机(德国Leica)，cobasc311型全自动生化分析仪(美国Roche)。大黄素购自西安小草植物科技有限责任公司，批号：XC100321，含量>98.15%，黄芩素购自西安小草植物科技有限责任公司，批号：XC100312，含量>98.14%，牛磺胆酸钠购自美国Sigma-Aldrich公司，批号：BCBG6336V，含量>97.0%，临用前用注射用水配成5%水溶液，0.22 μm无菌过滤。SPF级雄性Sprague Dawley(SD)大鼠120只，体质量210～230 g，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，合格证号：SCXK(陕2007-003)。本文涉及的动物实验经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会批准，批准号XJTULAC2017-764。

1.2 拆方设计 SPF级雄性SD大鼠120只，采用胰胆管逆行注射5%牛磺胆酸钠的方法制备SAP模型[18]96只，随机分为8组；另选正常大鼠24只作为对照，再分为正常组、假手术组，每组均12只。8组SAP模型具体用药情况如下：单纯SAP模型组(不用药物)、A组(大黄素3.2 mg/kg)、2A组(大黄素6.4 mg/kg)、B组(黄芩素7 mg/kg)、2B组(黄芩素14 mg/kg)、1/2AB组(大黄素1.6 mg/kg+黄芩素3.5 mg/kg)、AB组(大黄素3.2 mg/kg+黄芩素7 mg/kg)、2AB组(大黄素6.4 mg/kg+黄芩素14 mg/kg)，正常组(不做任何处理)，假手术组(开腹后仅翻动十二指肠、胰腺后关腹)。各组干预药物均于模型复制后立即尾静脉注射(药物溶液2 mL/kg)，正常组、假手术组、单纯SAP组尾静脉注射等量生理盐水。12 h后各组大鼠腹腔注射麻醉后，开胸，右心室取血，3000 r/min低温离心10 min，取上清液，由西安交通大学第二附属医院检验科罗氏cobasc311全自动生化分析仪检测ɑ-淀粉酶活性。同时收集胰腺组织，肉眼观察胰腺组织大体形态，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，切4 μm连续切片，行HE染色，显微镜下观察胰腺组织形态学变化。病理学评分标准参照 Schmidt 法(表1)[19]。依据上述胰腺组织病理学评分和血清α-淀粉酶活性结果作为疗效评价指标、判断AB交互作用：若疗效AB>2A，且AB>2B，则A、B协同；若AB>A或B，则A、B相加；若AB

表1 Schmidt胰腺组织病理评分标准

2 结果

2.1 一般情况 SAP组大鼠均出现精神萎靡、不好活动、四肢皮温较低等表现。各给药组均有所改善。

2.2 病理组织学变化 肉眼可见，正常组和假手术组腹腔正常，胰腺组织为粉红色，质地柔软，未见异常；单纯SAP组可见胰腺明显水肿，腹腔内有大量血性或黄色浑浊腹水，大网膜、肠系膜、腹后壁、肠壁可见大量浅黄色皂化斑。各给药组胰腺不同程度水肿，有的可见散在点状褐色坏死区，有少量腹水，但明显轻于单纯SAP组。镜下可见正常组和假手术组胰腺结构正常，无叶间隔增宽；单纯SAP组胰腺小叶间距增宽，腺泡细胞坏死，坏死区可见中性粒细胞浸润；各给药组胰腺组织病变均有不同程度减轻。与正常组相比，单纯SAP组和各治疗组病理学评分明显升高(P<0.05)，各治疗组均明显低于单纯SAP组(P<0.05)，AB组均明显低于2A和2B组(P<0.05)。各复方(1/2AB、AB、2AB组)随着剂量增加，胰腺组织病理学评分降低(P<0.05)，呈显著量效关系(图1、2)。

图1 各组大鼠胰腺组织病理学评分

2.3 血清α-淀粉酶活性变化 与正常组相比，单纯SAP组和各治疗组血清α-淀粉酶活性均明显升高(P<0.05)；各治疗组均明显低于单纯SAP组(P<0.05)，AB组均明显低于2A和2B组(P<0.05)，各复方组(1/2AB、AB、2AB组)之间血清α-淀粉酶活性之间差异无统计学意义(P>0.05)(图3)。

图2 各组大鼠胰腺组织HE染色(100×)

图3 各组大鼠血清α-淀粉酶活性

3 讨论

复方是利用药物相互作用来提高整体疗效的常见制剂手段，复方药物广泛应用于临床[20-22]。配比试验及拆方分析是验证复方配伍合理性的重要考量方法[23-25]，因此也就成为对复方药物进行多因素多水平分析的必须步骤。复方大黄素黄芩素是课题组对SAP经典方剂清胰汤进行精炼，筛选出的配方。前期已经完成的配比实验结果显示，复方大黄素黄芩素中大黄素是主药，黄芩素是次药[17]，最佳组方剂量为大黄素3.24 mg/kg和黄芩素7.12 mg/kg，大黄素、黄芩素的最佳剂量配比为1∶2.2。

拆方分析实施中的关键环节包括实验设计的合理性与疗效评价指标的正确选择。我们以5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射制备的SAP大鼠为研究对象，根据拆方分析的原则设计各组干预药物及动物分组：选择大黄素为阳性对照药，并设立阳性对照药单倍剂量大黄素组(A组)、阳性对照药2倍剂量大黄素组(2A组)、单倍剂量黄芩素组(B组)、2倍剂量黄芩素组(2B组)、复方低剂量组(1/2AB组)、复方中剂量组(AB组)、复方高剂量组(2AB组)，对复方大黄素黄芩素的二组分药大黄素、黄芩素的交互作用性质进行分析。拆方分析实验设计将复方中的主组分药大黄素作为阳性对照药，通过设置不同剂量拆方组，分析与主药大黄素相比复方药物是否提高了疗效(协同、相加)、是否不良反应降低(拮抗)。按照拆方分析的实验要求，所有试验均可选用复方中的主组分药大黄素作为阳性对照药，这种设计明显减少了拆方分析的实验分组数，大大提高了试验效率[25]。

病理学为疾病的诊断、分类和确定治疗方案以及为判断疾病进展、预后和疗效提供了客观依据，故本实验采用胰腺组织病理学变化作为评价SAP胰腺病变程度的主要指标。α-淀粉酶也是用于SAP辅助诊断的常用实验室指标，二者结合常用以评价SAP病情。本实验结果显示，各治疗组胰腺组织病理学评分和血清α-淀粉酶活性均明显低于单纯SAP组，AB组均明显低于2A和2B组(P<0.05)。1/2AB、AB、2AB组随着药物剂量增加，胰腺组织病理学评分降低(P<0.05)，血清α-淀粉酶活性下降趋势不明显(P>0.05)。由于病理学是诊断的金标准，本实验认为复方大黄素黄芩素小、中、大剂量范围内存在显著量效关系。

根据拆方分析判断药物相互作用关系(协同、相加、拮抗)的标准，本实验的结果为，复方大黄素黄芩素的疗效好于2倍剂量大黄素，也好于2倍剂量黄芩素。说明组方中大黄素、黄芩素之间为协同作用，二者合用提高了复方的疗效，为复方大黄素黄芩素组方的合理性提供了有利的实验证据。但是，复方大黄素黄芩素通过何种机制发挥作用，还需要进一步研究。

4 结论

复方大黄素黄芩素治疗SAP的疗效好于2倍剂量大黄素，也好于2倍剂量黄芩素，组方中大黄素、黄芩素之间为协同作用，复方大黄素黄芩素组方合理，可用于SAP的治疗研究。