周晓敏 孔嘉明 戴习林

摘要：【目的】明確SNP标记位点与罗氏沼虾生长性状间的关联性，为罗氏沼虾生长性状候选基因的寻找、生长性状调控机理及后期分子标记辅助育种研究打下基础。【方法】采用直接测序技术对25个SNP标记位点在罗氏沼虾生长性状极端群体中进行多态性检测。采用卡方检验（χ2）筛选出2个极端（体长极大和极小）罗氏沼虾群体中与生长状况存在潜在相关性的SNP标记位点，进一步对罗氏沼虾浙江群体60个个体进行SNP基因型与生长性状（体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重）的关联分析。运用一般线性模型对SNP标记位点与罗氏沼虾5个生长性状的关联性进行检测。【结果】卡方检验结果显示，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24等5个标记位点在罗氏沼虾极端群体中与生长性状存在潜在相关。5个潜在相关SNP标记位点与生长性状的相关性分析结果表明，SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4个位点与生长性状呈显著（P<0. 05，下同）或极显著（P<0. 01，下同）相关，其中位点SNP6与体长和体重关联极显著，与头胸甲宽关联显著;SNP7与体长、头胸甲宽、第一腹节宽和体重关联极显著，与第一腹节高关联显著;SNP16与头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重关联极显著，与体长关联显著;SNP24仅与第一腹节高关联显著。对浙江群体中60尾个体体长50%小个体和体长50%大个体2个群体中4个SNP位点的基因型频率进行统计，结果显示，SNP6和SNP24 2个标记与生长的关联性显著，SNP7和SNP16与生长的关联性极显著。【结论】HSP90和HGS基因可能是与罗氏沼虾生长相关的重要功能基因，研究结果为下一步基因定位及分子标记辅助育种提供了更多的标记基础。

关键词： 罗氏沼虾;生长性状;SNP标记位点;相关性分析

中图分类号： S966.12                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）08-2284-10

Correlation analysis of SNP markers loci with growth related traits of Macrobrachium rosenbergii

ZHOU Xiao-min， KONG Jia-ming， DAI Xi-lin*

（Shanghai Ocean University， Shanghai 201306， China）

Abstract：【Objective】To clarify the relationship between SNP marker loci and growth traits of Macrobrachium rosenbergii， so as to lay a foundation for the search of candidate genes for growth traits， the regulation mechanism of growth traits and the study of molecular marker-assisted breeding in the later stage. 【Method】The direct sequencing technique was used to detect the polymorphism of 25 SNP markers in the extreme population of growth traits of M. rosenbergii. Chi-square test （χ2） was used to screen two SNP marker loci with potential correlation with growth status in two extreme populations（maximum and minimum in body length） of M. rosenbergii. Further， the association between SNP genotypes and growth traits（body length， carapace  width， first abdominal segment width， first abdominal segment height and body weight） was analyzed in 60 individuals of M. rosenbergii Zhejiang population. The general linear model was used to detect the correlation between SNP marker loci and five growth traits of M. rosenbergii. 【Result】Chi-square test showed that SNP6， SNP7， SNP16， SNP20 and SNP24 were potentially associated with growth traits in M. rosenbergii population. The results of correlation analysis between five potential correlation SNP marker loci and growth traits showed that SNP6， SNP7， SNP16 and SNP24 were significantly（P<0.05， the same below） or extremely significantly（P<0.01， the same below） correlated with growth traits， in which SNP6 was extremely significantly correlated with body length and weight， and significantly correlated with carapace width， while SNP7 was extremely significantly correlated with body length， carapace width， first ventral segment width and body weight， and significantly correlated with first ventral segment height. SNP16 was extremely significantly correlated with carapace width， first abdominal segment width， first abdominal segment height and body weight， and significantly correlated with body length， while SNP24 was only significantly correlated with the first abdominal segment height. The genotypic frequencies of 4 SNP loci in 60 individuals with 50% small body length individuals and 50% large body length individuals in Zhejiang population were statistically analyzed. The results showed that 2 markers in SNP6 and SNP24 were significantly associated with growth， and SNP7 and SNP16 were extremely significantly associated with growth. 【Conclusion】HSP90 and HGS genes may be important functional genes related to the growth of M. rosenbergii.

Key words： Macrobrachium rosenbergii; growth traits; SNP markers loci; correlation analysis

Foundation item： Shanghai Shrimp Industry Technology System Construction Project（HNKCZ〔2014〕5）

0 引言

【研究意义】罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）生长快、食性杂、个体大、肉质好、易养殖，是我国主要的淡水养殖虾类（周劲松，2006），但伴随罗氏沼虾养殖业快速发展的同时，虾体生长缓慢、个体小型化及病害增多等种质退化现象日渐突出（周俊名等，2017），对罗氏沼虾养殖业的健康发展造成不利影响，因此，罗氏沼虾优良品种的选育工作势在必行。随着生物学研究层次的提高和实验手段的不断改进，良种选育已从传统的选择育种或杂交育种发展到分子标记辅助育种（Marker assisted selection，MAS），新技术的应用缩短了选育过程和育种速度，成为目前育种工作的重要辅助措施（樊庆灿等，2014;牛志刚等，2020）。关联分析是利用候选基因来分析表型与功能等位基因之间的相关性，是实现分子标记辅助育种的有效方法（刘思玮等，2013）。单核苷酸多态性（Single nucleotide polymorphism，SNP）从DNA序列水平对水产动物种质进行研究，分析不同群体间的遗传结构与遗传分化，能更准确地评定种质的遗传特性和相互间的关系，对群体遗传学的种群进化和群体结构研究具有重要的参考价值。当然，也可通过分析生物与经济性状的关联性，获得与经济性状相关联的遗传标记。由于其具有覆盖率高，易于基因分型等优点，被广泛运用于关联分析和分子辅助育种（樊庆灿等，2014;王赛等，2019）。【前人研究进展】在水产动物中，利用SNP标记与生长性状进行关联分析已有一些报道。倪静等（2011）分析了牙鲆（Paralichthys olivaceus）GH基因第1外显子区域中微卫星座位的多态性，同时对各基因型与其体重、体长等生长性状进行关联性分析，结果显示，基因型为AC的个体体重、头长和体高明显大于其他基因型个体，C是一个对体重、头长和体高有利的等位基因。王海芳（2014）运用比较基因组学、PCR技术和HRM等技术研究鳜（Siniperca chautsi）生长相关基因的SNPs及其与生长性状的相关性。陈静等（2018）采用PCR产物直接测序的方法研究MyoD基因多态性对草鱼（Ctenopharyngodon idella）生长性状的影响，认为MyoD基因的M1和M5突变位点可作为草鱼选育的候选分子标记。李胜杰等（2018）采用RNA-seq技术进行大口黑鲈（Micropterus salmoides）生长快和生长慢个体肌肉组织的转录组分析，采用Sna Pshot技术对检测到的其中75个EST-SNP标记在大口黑鲈生长性状极端群体中进行多态性检测，进一步采用一般线性模型分析37个EST-SNP标记与大口黑鲈生长性状的相关性，结果表明，CL1452.Contig9__All-847位点与生长性状显著相关（P<0.05），可用于大口黑鲈分子标记辅助育种。李纯等（2019）开展GHSR基因多态性对中华鳖（Pelodiscus sinensis）生长相关性状的影响研究，通过直接测序法在GHSR基因5侧翼和3侧翼上筛选SNPs位点，并分析其与生长性状的相关性，结果显示，检测到的所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。此外，在北极嘉鱼（Salvelinus alpinus L.）（Tao and Boulding，2003）、尖吻鲈（Lates calcarifer）（Xu et al.，2006）、凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei） （Ciobanu et al.，2010;Li et al.，2010）和斑节对虾（Penaeus monodon） （李运东，2016）等种类上也有相关报道。【本研究切入点】SNP标记是一种研究物种遗传多态性的理想分子标记，但在罗氏沼虾的研究中仍以微卫星为主，SNP标记鲜见应用于罗氏沼虾的遗传多态性分析。【拟解决的关键问题】利用直接测序技术，对25个扩增稳定的SNP标记位点进行多态性检测，对罗氏沼虾生长极端（体长极大和极小）个体筛选出具有与生长性状存在潜在相关性的SNP标记位点，进一步在随机选取的同一时期罗氏沼虾成虾浙江群体进行SNP基因型与生长性状的关联分析，筛选生长相关分子标记，为罗氏沼虾生长性状候选基因的寻找、生长性状调控机理及后期分子标记辅助育种研究打下基础。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

SNP生长位点初筛所用样品为从上海申漕特种水产实验基地饲养的罗氏沼蝦生长选育系F0中选取的体长5%极大值（Max，体长>9 cm）和5%极小值（Min，体长<2 cm）2种极端表型个体各30尾，关联分析所用样品为来自浙江南太湖养殖场中随机挑选同一时期的罗氏沼虾成虾60尾，测量其体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重5个生长相关性状数据，-20 ℃保存备用。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 DNA提取 采用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒（上海傲益生物科技有限公司）提取罗氏沼虾DNA，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测合格后用于后续试验。

1. 2. 2 引物合成及PCR产物测序 12对引物均由上海海洋大学戴习林实验室开发，由上海迈浦生物科技有限公司合成。进行PCR扩增，将检测合格的PCR产物送交上海迈浦生物科技有限公司测序，读取峰图。

1. 3 数据分析

使用PopGene 3.2对生长性状极端群体进行观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、哈温平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）和遗传多样性指数（Nei）分析和计算，在Cervus中计算位点多态信息含量（PIC）。卡方检验25个SNP标记位点与2个罗氏沼虾生长极端群体的相关性。采用一般线性模型（General linear model，GLM）（董玉和李琪，2016）对60尾浙江罗氏沼虾个体各位点基因型与其5个生长性状进行相关性分析，以体长、体重等形态性状为因变量，筛选得到的SNP标记位点的不同基因型为自变量。

2 结果与分析

2. 1 SNP在2个罗氏沼虾生长性状极端群体的多态性分析结果

使用12对引物进行扩增测序，共获得25个SNP标记位点，详见表1。在生长性状极端的罗氏沼虾群体中进行多态性检测，结果（表2）显示，除SNP13位点外均表现出多态性，PIC范围为0～0.38，平均值为0.28;Ho在0～0.70，平均值为0.27;He在0～0.51，平均值为0.36。哈温平衡分析发现极大虾群体中有10个SNP标记位点显著偏离平衡（P<0.05，下同），极小虾群体中有13个SNP标记位点显著偏离平衡。

2. 2 SNP标记与生长性状相关性分析结果

将25个SNP标记在2个生长性状极端罗氏沼虾群体中的各基因型比例进行统计（表3），经卡方检验，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24等5个标记位点在极端群体中与生长性状存在潜在相关性。进一步分析这5个SNP标记位点在浙江群体的遗传多样性，结果（表4）显示，其Ho介于0.20～0.62，平均值为0.36;He介于0.30～0.50，均值为0.42;平均PIC为0.33，均属于中度多态;哈温平衡检测结果显示，SNP7和SNP24位点显著偏离哈温平衡。

5个SNP标记位点在群体中均存在3种基因型（表3），各SNP标记位点与60个浙江个体关联分析结果（表5）显示，SNP6与体长和体重关联极显著（P<0.01，下同），与头胸甲宽关联显著;SNP7与体长、头胸甲宽、第一腹节宽和体重关联极显著，与第一腹节高关联显著;SNP16与头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重关联极显著，与体长关联显著;SNP24仅与第一腹节高关联显著;SNP20不同基因型与生长性状均不存在显著关联性（P>0.05，下同）。

对关联显著的4个SNP标记位点的不同基因型间生长性状进行多重比较，结果（表6）显示，SNP6位点的TT基因型个体5种性状参数的平均值均高于基因型CC和CT，并且体长、头胸甲宽和体重的差异均达显著水平;SNP7位点和SNP16位点的3种基因型在5个性状中均发现关联显著，且SNP7位点AA基因型所有个体的生长参数平均值均高于AG和GG基因型，并与AG基因型存在显著差异，SNP16位点GG基因型所有个体生长参数平均值小于另外2种基因型，与AG基因型呈显著差异;SNP24位点的3种基因型在第一腹节高性状中CG基因型与GG基因型存在显著差异。

2. 3 浙江群体体长前50%小个体和后50%大个体各SNP标记位点不同基因型分布

对浙江群体中60尾个体体长50%小个体和体长50%大个体2个群体中4个SNP标记位点的基因型频率进行统计（表7），经卡方检验，SNP6和SNP24与生长的关联性显著，SNP7和SNP16与生长的关联性极显著。

2. 4 各SNP标记位点不同基因型对应的生长性状分布

对与SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4个标记位点关联显著的生长性状统计其基因型分布，结果见图1。以ChymotrypsinBll-体长为例，由图1可看出，CC基因型所有个体体长参数中位线在7.99 cm处，CT基因型体长参数中位线在7.40 cm处，TT基因型体长参数中位线在8.35 cm处，且CC基因型的分布较分散。

3 讨论

面对罗氏沼虾养殖业的巨大发展空间及对养殖品种要求的不断提高，开展罗氏沼虾遗传育种工作，培育更多具有优良性状的新品种成为近年的研究方向。经济性状的遗传解析无疑是育种研究的热点之一（桂建芳等，2018）。群体遗传背景、连锁不平衡和样本含量大小等因素可影响SNP标记位点与群体目标性状相关性的准确性和可靠性（封利颖等，2013）。本研究对5个SNP标记位点在浙江群体中的多态性进行检测，结果发现5个标记位点的多态信息含量均高于0.25，属于中度多态，多态性较丰富，表明此5个SNP标记位点用于遗传多样性分析时有较高的有效性和可靠性;SNP7和SNP24显著偏离哈温平衡，说明这2个位点易受选种选配的影响。

罗氏沼虾的体长、头胸甲宽、第一腹节宽、第一腹节高和体重等是影响罗氏沼虾质量和产量的重要经济性状。SNP标记与罗氏沼虾生长性状的关联性分析显示SNP6和SNP7位点分别与罗氏沼虾的体长、体重关联极显著，SNP16位点与体长关联显著，与体重关联极显著，出现一个性状与多个SNP具有关联性现象。表明性状受多个基因（位点）控制，存在多因一效现象，而多因一效可能是基因连锁导致，符合数量性状的相关理论（郑先虎等，2011），也可能是性状由一个以上QTL控制，由不同的生理生化过程所调控（李仕贵等，2002）;位点SNP7和SNP16分别与5个生长性状关联显著或极显著，出现了几种不同的生长性状与同一个位点相关联，说明这5种生长性状之间也存在一定程度的关联;影响单一性状的基因只影响某一特定性状，如位点SNP24，仅与第一腹节高关联显著，与其他生长性状均无显著关联性。从表型到基因型的分子作用机理非常复杂（曾长英等，2006），通过分析罗氏沼虾不同基因型与生长性状的相关性，揭示这些标记位点存在一因多效或多因一效现象，可为罗氏沼虾不同生长性状间的种质选择提供参考。

对4个与生长性状显著相关的标记位点基因型进行分析，结果发现，不同基因型对应的生长性状分布规律与多重比较的结果相一致。如多重比较中（表5），Chymotrypsin基因CT基因型的体长（7.45±0.20 cm）小于CC基因型的体长（7.63±0.47 cm）和TT基因型的体长（8.43±0.20 cm）;CT基因型的体长中位数最小，TT基因型的体长中位数最大，进一步表明Chymotrypsin基因的CT基因型和TT基因型的体长存在差異。候选基因关联分析已成为确定某些水产养殖物种表型性状相关性遗传基础的方法，来自EST的外显子SNP一直是关联研究的主要目标，因为SNP可能通过改变所得蛋白质中存在的氨基酸（即非同义突变）来影响靶基因的生理功能（Genissel et al.，2004）。最近的一项研究表明，外显子区域的同义和非同义SNP对遗传应用（即作图和关联研究）同样有用，因为同义SNP也可能导致表型变异（Kimchi-Sarfaty et al.，2007）。在甲壳类动物中，大多数HSP形式的研究已用于评估与先天免疫反应或环境压力的关系，但一些研究表明它们参与了甲壳类动物肌肉生长，如凡纳滨对虾（Cesar and Yang，2007）。与甲壳类动物生长相关的HSP的第一个直接证据表明，HSP的推定功能作用不应仅限于先天免疫反应和环境压力（周玉兰等，2017;王晓雯等，2019），而必须扩展到生长。HGS基因为肝细胞生长因子激活因子，是一种来自于间充质的多效生长因子，具有高度保守性，能促进细胞生长和分化。关联分析中位点SNP7和SNP16与5个生长性状均关联显著或极显著，该2个位点分别位于HSP90基因和HGS基因，与上述文献不谋而合。在罗氏沼虾选育系F0生长性状极端群体中，SNP6、SNP7、SNP16、SNP20和SNP24表现出潜在相关性，但在浙江养殖群体中，只有SNP6、SNP7、SNP16和SNP24等4个位点表现出显著或极显著关联，其原因可能是试验样本量较少所致，也可能是样本所出自的家系材料不同导致，这也是试验用浙江群体进行进一步验证的原因。尽管如此，仍不能确保在此2个群体中都适用的标记也适用于其他群体，在后续研究中，还需要更大的验证群体及不同的育种系来进一步验证SNP标记与生长性状的相关性，寻找具有普遍性的、与生长相关的SNP标记，确定具有最佳遗传潜力的育种种群。

4 结论

HSP90和HGS基因可能是与罗氏沼虾生长相关的重要功能基因，研究结果为下一步基因定位及分子标记辅助育种提供了更多的标记基础。

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（责任编辑 麻小燕）

收稿日期：2020-06-24

基金项目：上海市虾类产业技术体系建设项目（沪农科产字〔2014〕第5号）

通讯作者：戴习林（1969-），https：//orcid.org/0000-0003-0595-9715，教授，主要从事海洋生物繁殖与发育生物学、甲壳动物增养殖及水环境调控研究工作，E-mail： xldai@ shou. edu.cn

第一作者：周晓敏（1992-），https：//orcid.org/0000-0002-7106-6803，研究方向为甲壳动物遗传育种，E-mail： 18616829502@163.com